劉逸寒，薄嘉鑫，喬婧，張超，王建玲，路福平

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

畢赤酵母表面展示磷脂酶D高密度發(fā)酵優(yōu)化

劉逸寒，薄嘉鑫，喬婧，張超，王建玲，路福平*

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

利用基因工程手段構(gòu)建獲得的一株細(xì)胞表面展示表達(dá)磷脂酶D的畢赤酵母工程菌株GS115/pKFS-pld，通過(guò)搖瓶單因素篩選進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，確定了最佳發(fā)酵條件為：誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段28℃，初始pH6.5，甲醇濃度1.5%，裝液量為30 mL/250 mL，250 r/min搖床培養(yǎng)144 h。在此優(yōu)化條件下菌體量為19.6 g/L，酶活達(dá)17.8×10-7kat/g，分別是是優(yōu)化前的1.38及1.44倍。同時(shí)進(jìn)行了5 L規(guī)模發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)，結(jié)果表明15 mL/（L·h）速率流加甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基6 h后，采用溶氧恒定流加法流加甲醇，誘導(dǎo)132 h后，菌體量及PLD活力分別達(dá)到67.4 g/L及27.3×10-7kat/g，是搖瓶發(fā)酵水平的3.44倍及1.53倍。

畢赤酵母表面展示；磷脂酶D；磷脂酰絲氨酸；發(fā)酵優(yōu)化；酶活力

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）是細(xì)胞膜磷脂成分之一，自從1942年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，便以其重要的生理功能吸引著科研工作者廣泛的關(guān)注。作為大腦中主要的酸性磷脂，PS可以提高腦細(xì)胞活力，改善記憶力，對(duì)預(yù)防和改善老年癡呆癥具有非常顯著的效果，另外對(duì)于提高大腦認(rèn)知力、消除大腦疲勞、緩解精神壓力和抑郁、平衡情緒也有一定療效，近年來(lái)更是被譽(yù)為“腦專一性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”[1-3]，由于其獨(dú)特的生理保健功能，作為一種功能性因子在食品領(lǐng)域擁有廣闊地應(yīng)用前景。

磷脂酶 D（EC3.1.4.4，phospholipase D,PLD），屬于催化磷酸二脂酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱，分布在從細(xì)菌到高等動(dòng)植物的眾多生物類群中。PLD具有的轉(zhuǎn)酯活性[4-5]可在高濃度絲氨酸存在條件下催化卵磷脂（PC）生成PS，目前已成為研究的熱點(diǎn)[6]。但PLD催化反應(yīng)是在兩相系統(tǒng)中進(jìn)行的，對(duì)于游離酶來(lái)講，有機(jī)溶劑常常降低其在非水相催化中的活力，且酶的分離、再生以及循環(huán)使用均有一定的困難。酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)可將外源蛋白基因與特定的載體基因融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，利用酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到膜表面的機(jī)制使靶蛋白固定化表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，從而實(shí)現(xiàn)酶的固定化[7-8]，因此利用酵母細(xì)胞表面展示PLD可有效克服上述缺點(diǎn)。

本試驗(yàn)對(duì)應(yīng)用微生物與酶工程研究室前期構(gòu)建獲得的細(xì)胞表面展示表達(dá)PLD的重組畢赤酵母工程菌株GS115/pKFS-pld的搖瓶發(fā)酵工藝及5 L規(guī)模發(fā)酵罐發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，旨在提高PLD表達(dá)量及工程菌株生長(zhǎng)量，為酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)PS提供基礎(chǔ)，進(jìn)一步促進(jìn)PS在我國(guó)食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

細(xì)胞表面展示表達(dá)PLD的畢赤酵母工程菌株P(guān)ichia pastoris GS115/pKFS-pld，由應(yīng)用微生物與酶工程研究室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 試劑

膽堿氧化酶、過(guò)氧化物酶：購(gòu)自Sigma公司；磷脂酰膽堿，苯酚，4-氨基安替比林，氯仿等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD，BMGY，BMMY，BSM，補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基，甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基等參考Invitrogen公司畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)。

1.2 方法

1.2.1 菌種YPD平板活化

從-70℃保存的甘油凍存管中挑取一環(huán)菌液，在YPD平板上劃線后,30℃培養(yǎng)48 h，至單菌落出現(xiàn)。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

1.2.2.1 YPD種子液培養(yǎng)

從活化平板上挑取1環(huán)單菌落接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min，培養(yǎng)20 h至OD600=2。

1.2.2.2 BMGY培養(yǎng)基富集培養(yǎng)

以5%接種量接種于50 mL/250 mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.2.3 BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)

于4℃，8000 r/min離心菌體富集培養(yǎng)液，無(wú)菌水洗滌菌體，轉(zhuǎn)接入50 mL/250 mL的BMMY培養(yǎng)基中，于30℃，pH 6.0，220 r/min振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)144 h，期間每24小時(shí)加入終濃度為0.5%的甲醇。

1.2.3 5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)

1.2.3.1 甘油分批培養(yǎng)階段

YPD培養(yǎng)種子液，以5%接種量接種于裝有2.5 L BSM培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)，28%氨水調(diào)節(jié)維持pH在最優(yōu)值，30℃，通氣量2.0 vvm，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制溶氧不低于30%。

1.2.3.2 甘油補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段

當(dāng)甘油耗盡后，溶氧（DO）陡然上升，此時(shí)流加不同濃度的甘油補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基4 h～6 h。

1.2.3.3 甲醇誘導(dǎo)階段

停止甘油流加后菌體饑餓生長(zhǎng)30 min～60 min后耗盡殘余甘油，采用兩種不同的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基流加方式進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)采用。

1）溶氧恒定流加法：轉(zhuǎn)速600 r/min恒定，使用恒定溶氧法，通過(guò)調(diào)節(jié)甲醇流加速度使溶氧不低于30%，誘導(dǎo)培養(yǎng)直至誘導(dǎo)結(jié)束。

2）甲醇恒速流加法：轉(zhuǎn)速恒定600 r/min，甲醇誘導(dǎo)階段開始2 h～4 h內(nèi)，3 mL/（L·h）流速流加甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基，2 h～4 h后，采用5.6 mL/（L·h）恒定速率流加甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基直至誘導(dǎo)結(jié)束。

1.2.4 菌體量及酶活的測(cè)定

1.2.4.1 菌體量的測(cè)定

取發(fā)酵液離心收集菌體，PBS緩沖液洗滌菌體，真空冷凍干燥至恒重，計(jì)算單位發(fā)酵液中細(xì)胞干重（DCW）。

1.2.4.2 PLD活力的測(cè)定

酶活單位定義為：以磷脂酰膽堿為底物，在pH 6.0，37℃條件下，每秒產(chǎn)生1 mol膽堿所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。測(cè)定方法采用膽堿顯色法[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母工程菌株搖瓶水平發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 BMMY培養(yǎng)基甲醇添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

在BMMY培養(yǎng)基中，甲醇主要作為碳源和誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑。甲醇添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響見圖1。

圖1 BMMY培養(yǎng)基中甲醇含量對(duì)GS115/pKFS-pld產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of methanol content on the enzyme production of GS115/pKFS-pld in BMMY medium

甲醇濃度為1.5%時(shí)，PLD活力最高達(dá)到12.4×10-7kat/g，菌體量到達(dá)13.6 g/L。

2.1.2 初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

畢赤酵母生長(zhǎng)的pH范圍較寬，然而表達(dá)不同的外源蛋白對(duì)最適pH的要求有差別。pH對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響見圖2。

圖2 BMMY培養(yǎng)基中pH對(duì)GS115/pKFS-pld產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of pH on the enzyme production of GS115/pKFS-pld in BMMY medium

當(dāng)pH為6.5，對(duì)PLD在細(xì)胞表面的展示表達(dá)最為有利，PLD活力達(dá)到13.4×10-7kat/g，菌體量到達(dá)14.8g/L。

2.1.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響見圖3。當(dāng)溫度為28℃時(shí)，PLD活力達(dá)到最高，為14.7×10-7kat/g。

2.1.4 裝液量對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

裝液量對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響見圖4。裝液量為30mL時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)最為有利，菌體量達(dá)到18.6 g/L，此時(shí)PLD活力達(dá)到最高，為17.1×10-7kat/g。

圖3 溫度對(duì)GS115/pKFS-pld產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of temperature on the enzyme production of GS115/pKFS-pld

圖4 裝液量對(duì)GS115/pKFS-pld產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of liquid volume on the enzyme production of GS115/pKFS-pld

2.1.5 轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)GS115/pKFS-pld產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of shaking speed on the enzyme production of GS115/pKFS-pld

當(dāng)轉(zhuǎn)速為250 r/min時(shí)，菌體量達(dá)到19.8 g/L，此時(shí)PLD活力達(dá)到最高，為17.8×10-7kat/g。

2.2 5 L規(guī)模發(fā)酵罐高密度發(fā)酵畢赤酵母工程菌株

2.2.1 甘油流加速度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

菌體生長(zhǎng)24 h后以不同速度流加對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見圖6。選擇15 mL/（L·h）的甘油流加速率。

圖6 不同甘油補(bǔ)料流速對(duì)GS115/pKFS-pld生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of glycerol feeding rates on the growth of GS115/pKFS-pld

2.2.2 甲醇流加模式對(duì)菌體生長(zhǎng)及誘導(dǎo)產(chǎn)酶的影響

甲醇流加模式對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響見圖7。

圖7 不同甲醇流加模式對(duì)GS115/pKFS-pld生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of methanol feeding method on the growth and enzyme production of GS115/pKFS-pld

根據(jù)DO值調(diào)節(jié)甲醇流加速率的甲醇恒速流加法效果較好，誘導(dǎo)132 h后，PLD活力達(dá)到24.0×10-7kat/g，此時(shí)菌體量為59.1 g/L。DO水平表明培養(yǎng)過(guò)程中菌體的代謝水平，DO的變化能反應(yīng)出碳源濃度的高低，這與Jimenes研究較為一致[10]，依據(jù)溶氧來(lái)緩慢調(diào)節(jié)甲醇的流速，既可以滿足目的蛋白表達(dá)的需要又不至于對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，從而使酶的表達(dá)量達(dá)到較高水平。

2.2.3 5 L規(guī)模發(fā)酵罐上的發(fā)酵

以搖瓶?jī)?yōu)化結(jié)果作為參考，選取初始pH 6.5，發(fā)酵溫度28℃，進(jìn)行5 L規(guī)模發(fā)酵罐試驗(yàn)，15 mL/（L·h）速率流加甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基6 h后，采用溶氧恒定流加法流加甲醇，結(jié)果見圖8所示。

圖8 5 L罐下優(yōu)化前后GS115/pKFS-pld生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線Fig.8 The curves of growth and enzyme production of GS115/pKFS-pld before and after optimization in 5L fermentor

誘導(dǎo)132 h后，菌體量及PLD活力分別達(dá)到最高為67.4 g/L及27.3×10-7kat/g，與未優(yōu)化條件相比（初始pH 6.0，發(fā)酵溫度30℃），菌體量提高了12.9%，PLD活力提高了14.6%。

3 結(jié)論

研究細(xì)胞表面展示PLD畢赤酵母基因工程菌株最優(yōu)發(fā)酵條件的目的是在菌體大量積累的情況下同時(shí)實(shí)現(xiàn)外源基因在酵母細(xì)胞表面的高效展示表達(dá)。通過(guò)對(duì)工程菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)條件：誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段28℃，初始pH 6.5，甲醇濃度1.5%，裝液量為30 mL/250 mL，250 r/min搖床培養(yǎng)144 h。在此優(yōu)化條件下菌體量19.6 g/L，酶活可達(dá)17.8×10-7kat/g，分別是是優(yōu)化前的1.38及1.44倍。在搖瓶條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行5 L規(guī)模發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)條件的優(yōu)化，在15 mL/（L·h）速率流加甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基6 h后，采用溶氧恒定流加法流加甲醇，誘導(dǎo)132 h時(shí)，菌體量及PLD活力分別達(dá)到最高為67.4 g/L及27.3×10-7kat/g，是搖瓶發(fā)酵水平的3.44倍及1.53倍。

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High Density Fermentation Optimization of Phospholipase D Displayed on Pichia pastoris Cell Surface

LIU Yi-han,BO Jia-xin,QIAO Jing,ZHANG Chao,WANG Jian-ling,LU Fu-ping*
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education;National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes;Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology;The College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China）

TheBMGY/BMMY medium and fermentation conditions of phospholipase D(PLD)displaying engineered strain Pichia pastoris GS115/pKFS-pld were optimized in single factor shake flask levels.The results indicated that the optimum fermentation conditions of GS115/pKFS-pld were the combination of the induced temperature 28℃,induced initial pH 6.5,methanol 1.5%(v/v),medium volume 30 mL/250 mL,and shaking at 250 r/min.Under these conditions,the PLD activity and DCW of GS115/pKFS-pld were significantly higher to 17.8×10-7kat/g and 19.6 g/L,which was increased by 38%and 44%,respectively,compared to the original conditions.Meanwhile,the optimization of culture conditions on GS115/pKFS-pld was scale-up in the 5 L fermentor.The biomass was rapidly enriched effectively when the glycerol fed-batch phase flow rate was setted at 15 mL/(L·h)and the flow time of glycerol was extended to 6 h,which could effectively increase the latter induced expression of PLD.By the methanol fed-batch stage using DO-stat method,the PLD activity and DCW of GS115/pKFS-pld reached 27.3×10-7kat/g and 67.4 g/L,which was 1.53 and 3.44 times of that the results in the shake,respectively.

Pichia pastoris surface display technology;phospholipase D;Phosphatidy lserine;fermentation conditions optimization;enzyme activity

*通信作者：路福平，男，教授，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃（2011AA100905－4）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31101219）

劉逸寒（1982—），男（漢），講師，博士，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程。

2011-12-10