鄧林紅，王 銳，陳園園

(重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶400030)

0 引言

電子掃描顯微鏡利用電子光學(xué)原理，用電子束和電子透鏡代替光束和光學(xué)透鏡，能夠使物質(zhì)結(jié)構(gòu)在非常高的放大倍數(shù)下成像，得到高分辨率的微觀圖像，但是這種圖像只能提供形態(tài)學(xué)上的表觀差異，無(wú)法定量或定性地分析圖像的差異。另一方面，細(xì)胞和組織與其周?chē)h(huán)境密切相關(guān)［1］，其中基底拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)更是能直接影響細(xì)胞的命運(yùn)［2，3］?；淄?fù)浣Y(jié)構(gòu)已成為當(dāng)今眾多生物傳感器和仿生材料調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)的重要手段［4，5］。因此，對(duì)材料拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的分析顯得尤為重要，而至今仍沒(méi)有一種行之有效的定性分析不規(guī)則多孔材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)差異的分析方法。本文提出了一種基于掃描電鏡的圖像處理算法，定性地分析不規(guī)則多孔材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的差異。

1 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.1 掃描電鏡成像

由電子槍發(fā)射的電子束經(jīng)會(huì)聚聚焦，在樣品表面形成一個(gè)具有一定能量和強(qiáng)度的電子束。由于入射電子與樣品之間的相互作用，將從樣品中激發(fā)出二次電子。由于周?chē)鷤鞲衅鞯淖饔每蓪⒏鱾€(gè)方向發(fā)射的二次電子匯集起來(lái)，加速射到光電傳感器上，使光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。這個(gè)電信號(hào)又經(jīng)視頻放大器放大輸送至顯像管的熒光屏上，從而呈現(xiàn)一幅亮暗程度不同的、反映樣品表面形貌的二次電子象。由于它利用電子束代替光束，電子透鏡代替光學(xué)透鏡，因此，它具有很高的分辨率，能夠在非常高的放大倍數(shù)下得到清晰的物質(zhì)表面微觀圖像［6］。

本實(shí)驗(yàn)以2種明膠濃度的明膠/羥基磷灰石復(fù)合鈦植入體材料為研究對(duì)象，其掃描電鏡圖像如圖1所示。但是這種圖像只能提供形態(tài)學(xué)上的表觀差異，無(wú)法定量或定性地分析圖像的差異。因此，本文提出了一種基于掃描電鏡的圖像處理算法，定性地分析不規(guī)則多孔材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的差異。

1.2 基于掃描電鏡的圖像處理算法

首先選擇相同放大倍數(shù)的電子掃描圖像，其次預(yù)處理將圖像按分水嶺算法轉(zhuǎn)換成二進(jìn)制圖像，灰度值的范圍為0～255，其中0代表黑色表示亮度最低，而255表示亮度最高顯示為圖像中的純白色。其中閾值的選擇采用全局閾值方法，在閾值選擇前，要對(duì)所需要處理的圖像進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)，一般是采用觀察直方圖來(lái)選擇?？讖絻?nèi)部的像素點(diǎn)灰度值比較小，周?chē)牧炼缺容^大，因此，直方圖會(huì)有2個(gè)波峰，選擇2個(gè)波峰的中間波谷的灰度值即可作為閾值。在轉(zhuǎn)換之前可適當(dāng)進(jìn)行平滑處理以讓邊界輪廓清晰提高信噪比。最后選用顆粒分析工具提取孔徑特征值，諸如面積、圓度等，用高斯擬合曲線(xiàn)對(duì)比兩者的差異，如圖2。

圖1 兩種明膠濃度的明膠/磷灰石復(fù)合鈦材料表面掃描電鏡圖像Fig 1 SEM results of gelatin/hydroxyapatite composite titanium surface with two different concentration of gelatin

圖2 Image J圖像處理分析孔徑特征流程圖Fig 2 Flow chart of pore characterization analysis based on Image J processing

1.3 數(shù)據(jù)分布曲線(xiàn)擬合

將按上述算法得到的孔徑特征值在Matlab中進(jìn)行擬合。根據(jù)數(shù)據(jù)特征的不同，可以進(jìn)行不同的擬合，如二項(xiàng)分布，多項(xiàng)式分布，正態(tài)分布等。由于本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象是一個(gè)隨機(jī)的正態(tài)分布，因此，進(jìn)行高斯擬合，如式(1)

高斯分布也稱(chēng)正態(tài)分布，有2個(gè)參數(shù)即均值μ和標(biāo)準(zhǔn)差σ，可記作N(μ，σ):均值μ決定正態(tài)曲線(xiàn)的中心位置;標(biāo)準(zhǔn)差σ決定正態(tài)曲線(xiàn)的陡峭或扁平程度。σ越小，曲線(xiàn)越陡峭;σ越大，曲線(xiàn)越扁平。

2 結(jié)果

2.1 基于掃描電鏡的圖像處理算法提取孔徑邊界

從圖3中可以看出:(b)是圖像(a)經(jīng)圖像處理算法轉(zhuǎn)換之后提取的孔徑輪廓，(d)是圖像(c)經(jīng)圖像處理算法轉(zhuǎn)換之后提取的孔徑輪廓，從中可以看出:基于ImageJ圖像處理系統(tǒng)提取的孔徑輪廓清晰，精確度高，而且便于后續(xù)計(jì)算分析。

2.2 孔徑特征值數(shù)據(jù)的曲線(xiàn)擬合

由于本研究對(duì)象是一隨機(jī)過(guò)程，可以將基于掃描電鏡的圖像處理算法提取的孔徑特征值概率密度首先做直方圖，然后進(jìn)行高斯曲線(xiàn)擬合。因此，對(duì)圓度和面積分別進(jìn)行高斯擬合，如圖4和圖5所示。

圖3 基于掃描電鏡的圖像處理算法提取的孔徑邊界Fig 3 Pore boundary based on SEM image processing algorithm extraction

圖4 Image J圖像處理提取的孔徑面積正態(tài)分布擬合圖像Fig 4 Gaussian distribution fitting diagram of pore area based on Image J processed

圖5 Image J圖像處理提取的孔徑面積正態(tài)分布擬合圖像Fig 5 Gaussian distribution fitting image of pore area based on Image J processed

從擬合結(jié)果(表1)中可以看出二者的圓度均服從正態(tài)分布(記為N(μ，σ))，經(jīng)過(guò)T檢驗(yàn)，150 mg/L復(fù)合鈦的圓度顯著大于100 mg/L復(fù)合鈦(P＜0.05)。而孔徑面積分布以1μm2為分界線(xiàn)，呈現(xiàn)2個(gè)不同的正態(tài)分布。經(jīng)T檢驗(yàn)，面積在小于1μm2時(shí)二者無(wú)顯著差異(P＞0.05)，而在大于1μm2時(shí)二者有顯著差異(P＜0.05)。因此，本算法系統(tǒng)能夠定性分析出材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的差異和特征分布。

表1 高斯擬合結(jié)果Tab 1 Gaussian fitting results

3 結(jié)論

本文基于電鏡掃描，結(jié)合Image J圖像處理算法和曲線(xiàn)擬合的算法系統(tǒng)能定性地分析出多孔材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的差異，該方法具有較高精確性，其過(guò)程和方法靈活具有廣泛的適用性。同時(shí)，對(duì)于生物多孔材料和納米材料與生物細(xì)胞的關(guān)系認(rèn)識(shí)上有重要意義。

［1］Schneider R K，Knuchel R，Neuss S.Mesenchymal stem cells and their interaction with biomaterials:Potential applications in tissue engineering［J］.Pathologe，2011，32(2):296－303.

［2］Mrksich M，Kilian K A，Bugarija B，et al.Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells［C］∥Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010:4872－4877.

［3］McBeath R，Pirone D M，Nelson CM，et al.Cell shape，cytoskeletal tension，and RhoA regulate stem cell lineage commitment［J］.Dev Cell，2004，6(4):483－495.

［4］Martinez E，Engel E，Planell J A，et al.Effects of artificial microand nano-structured surfaces on cell behaviour［J］.Annals of A-natomy-Anatomischer Anzeiger，2009，191(1):126－135.

［5］Liu X，Smith L A，Hu J，et al.Biomimetic nanofibrous gelatin/apatite composite scaffolds for bone tissue engineering［J］.Biomaterials，2009，30(12):2252－2259.

［6］于麗芳，楊志軍，周永章，等.掃描電鏡和環(huán)境掃描電鏡在地學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用綜述［J］.中山大學(xué)研究生學(xué)刊，2008，29(1):54－60.