左 奪，張學(xué)博*，張信文，孫穎郁，曾少舉，劉 斌

（1.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 海口 571158；

2.北京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875；

3.北京動物園，北京 100044）

朱鹮聽覺發(fā)聲中樞和內(nèi)分泌核團內(nèi)P物質(zhì)的定位

左 奪1，張學(xué)博1*，張信文1，孫穎郁2，曾少舉2，劉 斌3

（1.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571158；

2.北京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875；

3.北京動物園，北京 100044）

朱鹮為世界瀕危物種、用免疫組織化學(xué)方法對朱鹮腦內(nèi)聽覺-發(fā)聲中樞和內(nèi)分泌核團中的P物質(zhì)免疫陽性神經(jīng)細胞、終末和纖維進行了定位：1）在聽覺通路中的延髓耳蝸核、腦橋腹部外側(cè)丘系核、中腦背外側(cè)核殼、中腦丘間核殼、丘腦卵圓核殼等有P物質(zhì)陽性纖維和終末；在腦橋橄欖核有P物質(zhì)陽性神經(jīng)細胞；2）在發(fā)聲通路中的氣管鳴管亞核、中腦丘間復(fù)合體背內(nèi)側(cè)核、丘腦前背外側(cè)核內(nèi)部、古紋狀體腹部中間區(qū)有P物質(zhì)陽性神經(jīng)細胞和終末；3）在視前區(qū)前核、下丘腦外側(cè)核，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核等內(nèi)分泌核團有P物質(zhì)陽性神經(jīng)細胞.結(jié)果提示：P物質(zhì)在聽覺通路和聽覺旁通路、發(fā)聲通路和生殖內(nèi)分泌相關(guān)的核團中表達豐富，鳥腦中的P物質(zhì)可能參與聽覺和鳴叫行為以及交配和生殖等生理功能的調(diào)制.

朱鹮；P物質(zhì)；發(fā)聲中樞；聽覺中樞；內(nèi)分泌核團

朱鹮（Nipponia nippon）為世界瀕危物種[1]，國內(nèi)外已對朱鹮的生態(tài)學(xué)及保護生物學(xué)等方面做了較詳細的研究[2-3]，但對其腦的解剖等的研究很少，對其腦內(nèi)P物質(zhì)（substance P，SP）的定位，國內(nèi)外尚無報道.P物質(zhì)是氨基酸類的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，在鳥類的腦活動中起一定的調(diào)制作用，可以調(diào)制多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，以此參予多種腦活動的調(diào)節(jié)[4-6].本實驗用P物質(zhì)免疫組化技術(shù)和圖像儀分析系統(tǒng)，對P物質(zhì)在朱鹮聽覺發(fā)聲中樞和內(nèi)分泌核團內(nèi)的分布做了定位分析.

1 材料和方法

1.1 焦油紫染色

實驗動物：朱鹮腦（♂1只，意外死亡）由北京動物園贈送.將腦剝離出來，放入4%多聚甲醛固定2d后轉(zhuǎn)入30%的蔗糖液.在低溫恒冷切片機下把腦切成40 μm的切片，貼于用明膠處理過的載玻片上，用0.1%的焦油紫染色后進行脫水脫脂，將切片制成永久切片，于顯微鏡下鏡檢.

1.2 P物質(zhì)-DAB免疫組化流程

0.01 mol/L PBS漂洗，5min×3次，3%正常羊血清（TritonX-100/PBS稀釋）室溫封閉30 min，兔抗P物質(zhì)（中杉金橋，1∶200），4℃孵育過夜，室溫反應(yīng)2h，0.01 mol/L PBS漂洗，5min×3次，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG（Vector，1∶400）室溫反應(yīng)2h，0.01 mol/L PBS漂洗，5min×3次，ABC復(fù)合物（Vector，1∶200），室溫反應(yīng)2h，0.01 mol/L PBS漂洗，5min×3次，DAB（Diaminobenzidine tetrahydra chloride）（6%）和30%H2O2（0.6%）的Tris-Cl稀釋工作液避光顯色30-40 min，蒸餾水漂洗、貼片、脫水、透明、封片.

1.3 圖像采集與數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Olympus明視野光學(xué)顯微鏡以及Cool-SNAP數(shù)碼照相系統(tǒng)，采集X區(qū)的P物質(zhì)免疫染色圖像，朱鹮核團的定位和命名參考鴿、金絲雀腦立體定位圖譜和張信文等以前的工作[7-9]為依據(jù).選取核團的中央截面及內(nèi)外各200 μm截面共3張腦片進行統(tǒng)計，在每張腦片核團內(nèi)部和周圍區(qū)域分別取3個不同的約500 μm2的長方形，用圖像分析軟件（Image Pro Plus軟件）分別計算其灰度（gray value），我們將3張截面核團周圍區(qū)域內(nèi)9個選定區(qū)域的平均灰度值減去核團內(nèi)部共9個選定區(qū)域的平均灰度值的差值定義為消減平均灰度（sub?tracted mean gray value），即背景物平均灰度與陽性物平均灰度之差作為統(tǒng)計對象.經(jīng)SPSS 13.0軟件的K-S檢驗確認各組數(shù)據(jù)為正態(tài)分布后，應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件Prism 4進行單因素方差分析（LSD），比較多組間差異，實驗結(jié)果列表1，當(dāng)P＜0.05時差異顯著；當(dāng)P＜0.01時差異極顯著.

2 結(jié)果

2.1 延髓和腦橋內(nèi)P物質(zhì)的定位

在朱鹮的延髓舌下神經(jīng)核（nXII）和氣管鳴管亞核，舌下神經(jīng)（NXII）內(nèi)有許多P物質(zhì)標(biāo)記的神經(jīng)終末和纖維（見圖1-1），舌下神經(jīng)核和氣管鳴管亞核呈不規(guī)則形，位于延腦的背側(cè)，矢狀切面積約1.26 mm2.在朱鹮的延髓耳蝸核（nCo）和角狀核有濃重的P物質(zhì)免疫陽性神經(jīng)終末（見圖1-2，表1），耳蝸核和角狀核位于第四腦室的腹側(cè),延髓的背外側(cè),矢狀切面積約1.09 mm2.在聽神經(jīng)（NⅧ）有一些P物質(zhì)陽性神經(jīng)纖維（見圖1-2）.在腦橋的橄欖核（SO）有P物質(zhì)的免疫陽性細胞（見圖1-3），橄欖核位于腦橋尾部的腹側(cè)緣，呈球形，矢狀切面積為0.69 mm2.在腦橋腹部外側(cè)丘系核（VLV）有P物質(zhì)陽性神經(jīng)終末（見圖1-4）.

表1 朱鹮腦內(nèi)SP免疫陽性物質(zhì)的部分灰度值Tab.lThe density of the SP positive substances in the brain in Nipponia nippon

2.2 中腦和間腦內(nèi)P物質(zhì)的定位

圖1 朱鹮腦內(nèi)P物質(zhì)的分布Fig.1 The distribution of substance Pin the brain of Nipponia Nippon

在中腦主要觀察到：在中腦丘間復(fù)合體背內(nèi)側(cè)核（DM）有密集的P物質(zhì)免疫陽性神經(jīng)終末，矢狀切面積約0.64 mm2（見圖1-5）.在中腦背外側(cè)核（MLd）殼（見圖1-6，表1）和中腦丘間核（ICo）殼有許多P物質(zhì)免疫陽性終末和細胞，濃密的標(biāo)記纖維分布在ICo和MLd周圍區(qū)（見圖1-7）.ICo殼分為內(nèi)側(cè)丘間核（mICo）和外側(cè)丘間核（lICo），通過焦油紫染色將ICo殼、DM和MLd殼區(qū)分開來.標(biāo)記細胞、終末與纖維分布在中腦背外側(cè)核殼上（見圖1-6，7）.在卵圓核殼（OV-Shell）有許多濃重的P物質(zhì)免疫陽性神經(jīng)終末和纖維（見圖1-8，表1），OV-Shell包括OV核前部（Ova），Ov核后部（Ovp）.在下丘腦腹內(nèi)側(cè)核（VMN）、VMN-Shell區(qū)有許多濃重的P物質(zhì)免疫陽性細胞和纖維（見表1）.下丘腦外側(cè)區(qū)內(nèi)有許多濃重的P物質(zhì)免疫陽性細胞（見表1）.在丘腦前背外側(cè)核內(nèi)部（DLM）有許多濃重的P物質(zhì)免疫陽性橢圓形細胞和終末（見圖1-9，表1）.

2.3 端腦內(nèi)P物質(zhì)的定位

在舊紋狀體增加部（PA）內(nèi)有許多的P物質(zhì)神經(jīng)細胞（見圖1-10），位于LMD下方.在古紋狀體腹部中間區(qū)（AiV）內(nèi)有許多濃重的P物質(zhì)免疫陽性神經(jīng)細胞（見圖1-11，表1）.在視前區(qū)前核（POA）有濃重的P物質(zhì)免疫陽性神經(jīng)細胞和纖維（見圖1-12，表1）.

3 討論

P物質(zhì)是興奮性神經(jīng)肽，也是一種腦腸肽，屬于速激肽家族一類，具有相似羧基端氨基酸序列和生物活性的神經(jīng)肽，廣泛地分布在中樞和周圍神經(jīng)組織中，具十一肽序列Arg1-Pro2-Lys3-Pro4-Gln5-Gln6-Phe7-Phe8-Gly9-Leu10-Met11-NH.P物質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與多種生理過程，如疼痛，學(xué)習(xí)和記憶等，主要存在于中腦、下丘腦、視前區(qū)、基底神經(jīng)節(jié)及邊緣系統(tǒng)[4-6].本實驗結(jié)果表明，P物質(zhì)在朱鹮腦中分布于聽覺通路和聽覺旁通路、發(fā)聲控制系統(tǒng)和生殖內(nèi)分泌相關(guān)的核團等三個系統(tǒng)中表達豐富，這些提示P物質(zhì)可能與鳥類的聽覺和鳴叫行為等多種生理功能有關(guān).

3.1 聽覺通路中的P物質(zhì)定位

鳥類的聽覺通路主要由聽神經(jīng)（NⅧ）先投射到延髓耳蝸核的角狀核和巨細胞核團，再投射到層狀核、腦橋橄欖核和腦橋腹部外側(cè)丘系核，然后再投射到中腦背外側(cè)核、丘腦卵圓核，最后投射到端腦L聽區(qū)[10-11]，另外由中腦MLd殼、ICo殼、丘腦OV殼和新紋狀體旁聽區(qū)等組成旁聽覺通路[12].本實驗在朱鹮的聽覺通路和旁聽覺通路的多數(shù)核團：聽神經(jīng)、延髓耳蝸核、腦橋橄欖核和腦橋腹部外側(cè)丘系核、中腦MLd殼、ICo殼和丘腦OV殼內(nèi)有許多的P物質(zhì)免疫陽性神經(jīng)細胞和纖維，這些結(jié)構(gòu)都參與聽覺中繼的生理反應(yīng)[13].P物質(zhì)大量分布在MLd殼、OV殼等核團的殼上，說明P物質(zhì)在旁聽覺通路中可能起重要的調(diào)制作用.

3.2 發(fā)聲控制通路中的P物質(zhì)定位

P物質(zhì)廣泛分布于發(fā)聲控制通路中，已知鳥類的鳴叫由腦內(nèi)發(fā)聲控制通路所控制，鳥類的發(fā)聲通路由端腦古紋狀體腹部中間區(qū)→中腦丘間復(fù)合體背內(nèi)側(cè)核→氣管鳴管亞核，然后支配氣管鳴管肌[10-11，14].本實驗結(jié)果表明，在朱鹮發(fā)聲控制通路腦區(qū)古紋狀體腹部中間區(qū)、中腦丘間復(fù)合體背內(nèi)側(cè)核和氣管鳴管亞核富含P物質(zhì)胞體及纖維，提示P物質(zhì)作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)，可能通過興奮其他神經(jīng)遞質(zhì)或受體，從而在發(fā)聲控制等功能中發(fā)揮一定的調(diào)制作用.

3.3 P物質(zhì)在聽覺-發(fā)聲和生殖內(nèi)分泌核團中的定位

已知鳥類求偶炫耀，交配和生殖活動與生殖內(nèi)分泌有關(guān)的腦區(qū)，包括視前區(qū)前核、下丘腦外側(cè)核，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和下丘腦的各個亞核有著密切的關(guān)系[12].而鳥類的聽覺和發(fā)聲，以及生殖內(nèi)分泌三個系統(tǒng)之間有密切的聯(lián)系，其中聽覺高位中樞L聽區(qū)投射到發(fā)聲高位中樞[10-11]，聽覺反饋調(diào)控發(fā)聲行為[15-16].下丘腦的視前區(qū)前核、下丘腦外側(cè)核，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核與旁聽覺通路有直接的神經(jīng)聯(lián)系，由此聽覺和發(fā)聲以及生殖內(nèi)分泌神經(jīng)核團組成了發(fā)聲—聽覺—內(nèi)分泌下丘腦軸系統(tǒng)[10-12].本實驗結(jié)果表明，在發(fā)聲—聽覺—內(nèi)分泌下丘腦軸系統(tǒng)內(nèi)均有P物質(zhì)免疫陽性神經(jīng)細胞或纖維的分布，提示鳥腦中的P物質(zhì)可能與聽覺和鳴叫行為，以及交配和生殖活動等多種生理調(diào)控有關(guān).其發(fā)聲—聽覺—內(nèi)分泌下丘腦軸系統(tǒng)的調(diào)控機制還有待于進一步深入的研究.

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The Localization of Substance P in the Vocal Center and the Audi?tory Center and Endocrine Nuclei in the Brain of Nipponia Nippon

ZUO Duo1，ZHANG Xuebo1＊，ZHANG Xinwen1，SUN Yingyu2，ZENG Shaoju2，LIU Bin3

（1.College of Life Science，Hainan Normal University，Haikou571158，China；
2.College of Life Science，Beijing Normal University，Beijing100875，China；
3.Zoo Beijing，Beijing100044，China）

The distribution of substance P in the brain ofNipponia nipponwas investigated by use of immunohisto?chemical methods,and the gray density of numerical value was measured with the image processing system.1）The sub?stance P labeled terminal and cells were distributed in the auditory center such as the nCo,superior olivary nucleus（SO），nucleus ventralis lemnisci lateralis（VLV）,the shell regions of mesencephalicus lateralis,pars dorsalis（MLd shell）,the nucleus ovoidalis shell（Ov shell）et al;2）In the vocal control nuclei such as the nucleus hypoglossi,pars tracheosyringealis（nXIIts）,nucleus dorsalis medialis（DM）and the nucleus intercollicularis（ICo）,dorsolateral nucle?us of the anterior thalamus（DLM）,AiV of Nipponia nippon.3）In the endocrine nuclei such as nucleus ventromedialis hypothalamic（VMN）,nucleus lateralis hypothalamic（LHy）,nucleus preopticus anteror（POA）et al;The results indi?cate that substance P may play an important physiological role in the auditory-vocal-endocrine hypothalamic axis.

Nipponia nippon；Substance P；Vocal center；Auditory center；Endocrine nuclei

Q 958

A

1674-4942（2012）01-0081-05

2011-12-20

國家自然科學(xué)基金資助項目（31160205）

*通訊作者

黃 瀾