汪海新 應(yīng)明真 王 梅

一、概 述

人類(lèi)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ結(jié)合蛋白1(DNAtopoisomeraseⅡβ－bindingprotein1，TopBP1)是最初于1997年由Yamane等人經(jīng)雙雜交篩選分離得到的一種能結(jié)合到DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ蛋白C末端區(qū)域的蛋白［1］。TopBP1基因定位于人類(lèi)染色體3q22.1，含29個(gè)外顯子，編碼的TopBP1蛋白含1522個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量180kDa。人類(lèi)TopBP1蛋白的同系物包括爪蟾的Xcut5/Xmus101，果蠅的Mus101，線(xiàn)蟲(chóng)的MUS－101，擬南芥的Mei1，啤酒酵母的Dpb11，裂殖酵母的Cut5/Rad4等［2］。

TopBP1與乳腺癌易感基因1蛋白(breastcancer susceptibilitygene1，Brca1)存在結(jié)構(gòu)上的同源性，表現(xiàn)在TopBP1蛋白包含8個(gè)Brca1羧基末端(brca1 carboxyterminus，BRCT)功能域。BRCT功能域能夠和其他的BRCT功能域、非BRCT功能域，以及DNA鏈斷裂區(qū)域結(jié)合，在DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮作用［3］。低等真核生物和酵母的TopBP1同系物較脊椎動(dòng)物的TopBP1蛋白要小很多，比如果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)和酵母的TopBP1同系物就分別有7個(gè)、6個(gè)和4個(gè)BRCT功能域，表明這些功能域在生物體進(jìn)化過(guò)程中逐漸產(chǎn)生并增加了不同的功能［4］。TopBP1能與多種蛋白相互作用且有特定的結(jié)合區(qū)域，例如TopBP1與多聚ADP核糖聚合酶1［poly(ADP－ribose)polymerase－1，PARP－1］的自動(dòng)ADP核糖基化位點(diǎn)有序列同源性，這兩種蛋白的相互作用依賴(lài)于TopBP1的第6BRCT功能域［5］。

DNA雙鏈斷裂(DNAdouble－strandbreak，DSB)是最嚴(yán)重的DNA損傷，哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA修復(fù)基因或蛋白表達(dá)異常造成修復(fù)能力下降或缺乏可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定以及腫瘤的發(fā)生［6］。TopBP1是一種重要的蛋白，在維持基因組穩(wěn)定性方面有多種功能，本文就TopBP1蛋白在DNA損傷修復(fù)及乳腺癌發(fā)生中的作用做一綜述。

二、TopBP1參與DNA損傷反應(yīng)

真核細(xì)胞基因組經(jīng)常面臨因暴露于外源性或內(nèi)源性DNA損傷因子而導(dǎo)致的基因突變壓力，在S期更易出現(xiàn)DNA斷裂，若不能修復(fù)或不正確修復(fù)，對(duì)細(xì)胞活性和基因組穩(wěn)定性將產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。DNA雙鏈斷裂主要通過(guò)同源重組(homologousrecombination，HR)及非同源末端連接(nonhomologousendjoining，NHEJ)途徑修復(fù)。圍繞這些修復(fù)通路，哺乳動(dòng)物產(chǎn)生DNA損傷反應(yīng)(DNAdamageresponse，DDR)，其作用是察覺(jué)DNA損傷和激活信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，用以啟動(dòng)損傷修復(fù)及阻滯細(xì)胞周期直至修復(fù)完成［7］。TopBP1具有與多種DNA損傷反應(yīng)蛋白相互作用的能力，參與DNA損傷反應(yīng)過(guò)程。

真核細(xì)胞DNA雙鏈斷裂后通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而激活DNA修復(fù)過(guò)程及細(xì)胞周期檢查點(diǎn)。在高等真核細(xì)胞，染色質(zhì)DNA雙鏈斷裂迅速啟動(dòng)組蛋白變異體H2AX在139位絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，形成γH2AX，并以此作為DNA損傷引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)核心組分的聚集場(chǎng)所，因而γH2AX的形成被認(rèn)為是DNA雙鏈斷裂損傷的標(biāo)志。γH2AX的磷酸化過(guò)程需要磷酸肌醇3－激酶相關(guān)激酶(phosphoinositide3－kinaserelated kinases，PIKK)家族成員毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變蛋白(ataxiatelangiectasiamutated，ATM)、ATM與Rad3相關(guān)蛋白(ATMandRad3related，ATR)和DNA依賴(lài)性蛋白激酶催化亞單位(DNAdependentproteinkinase catalyticsubunit，DNA－PKcs)的激活，其中以ATM為主［8］。γH2AX形成后隨即招募其他DNA損傷反應(yīng)蛋白，包括 Nijmegen斷裂綜合征蛋白1(Nijmegen breakagesyndrome1，Nbs1)、P53結(jié)合蛋白 1(P53 bindingprotein1，53BP1)、DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白調(diào)節(jié)子1(mediatorofDNAdamagecheckpointprotein1，MDC1)和TopBP1等。在DNA損傷反應(yīng)中Mre11－Rad50－Nbs1(MRN)復(fù)合體有助于TopBP1與ATM相聯(lián)系，而TopBP1的第1、2BRCT功能域能與MRN復(fù)合體中Nbs1亞單位相互作用，維持DNA雙鏈斷裂后正常的檢查點(diǎn)功能［9］。免疫共沉淀 TopBP1和53BP1提示這兩個(gè)蛋白能夠物理接觸且相互作用。在DNA雙鏈斷裂時(shí)，TopBP1和53BP1共定位于DNA損傷位點(diǎn)，TopBP1的第4、5BRCT功能域與53BP1相互作用，在G1期介導(dǎo)53BP1的檢查點(diǎn)功能［10］。MDC1是細(xì)胞應(yīng)對(duì)DNA雙鏈斷裂的重要檢查點(diǎn)蛋白，Wang等［11］研究發(fā)現(xiàn)TopBP1與MDC1在控制DNA復(fù)制檢查點(diǎn)方面有功能相關(guān)性。特異性TopBP1－MDC1相互作用是由TopBP1的第5BRCT功能域與MDC1的絲氨酸－天冬氨酸－蘇氨酸殘基重復(fù)序列介導(dǎo)，從而DNA雙鏈斷裂信號(hào)經(jīng)H2AX/ MDC1級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)放大后，使TopBP1聚集于阻滯的復(fù)制叉。TopBP1與這些蛋白之間的生物學(xué)行為上調(diào)和穩(wěn)定了TopBP1和γH2AX的共定位效應(yīng)，從而也證明TopBP1參與DNA損傷反應(yīng)過(guò)程。

作為多功能腫瘤抑制因子的早幼粒細(xì)胞白血病蛋白(promyelocyticleukemiaprotein，PML)在DNA雙鏈斷裂同源重組修復(fù)中對(duì)Rad51、Mre11、Brca1蛋白的聚集和定位都有作用，而 PML過(guò)表達(dá)有穩(wěn)定TopBP1的作用［12］。Morishima等［13］在用siRNA沉默TopBP1后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)絲裂霉素C和電離輻射敏感性增加，自發(fā)性或絲裂霉素C誘導(dǎo)性的姐妹染色單體互換水平下降，且經(jīng)TopBP1siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞同源重組修復(fù)較正常對(duì)照細(xì)胞下降2倍。從而說(shuō)明TopBP1在DNA雙鏈斷裂同源重組修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

三、TopBP1是ATR－Chk1通路的介導(dǎo)蛋白

在DNA損傷反應(yīng)的頂點(diǎn)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的蛋白激酶ATM、ATR和DNA－PKcs都屬于PIKK激酶家族，能夠探查到損傷的DNA、阻滯的復(fù)制叉或DNA修復(fù)的中間體。DNA雙鏈斷裂激活A(yù)TM和DNA－PKcs，而DNA雙鏈斷裂、復(fù)制應(yīng)激、堿基加合物及DNA鏈交聯(lián)均可激活A(yù)TR［14］。ATR被激活后可使下游眾多底物磷酸化，其中最重要的是檢查點(diǎn)激酶蛋白1 (checkpointkinaseprotein1，Chk1)的磷酸化，使得DNA損傷信號(hào)進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)到p53、Cdc25A、Cdc25C等，從而在DNA損傷后復(fù)制起始、復(fù)制叉穩(wěn)定性、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和DNA修復(fù)方面發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)［15］。ATR是細(xì)胞生存所必需的，功能上相當(dāng)于DNA損傷反應(yīng)的主調(diào)節(jié)器，因而ATR－Chk1通路是DNA損傷反應(yīng)中的重要通路。

ATR能被多種DNA損害所激活，而通用的刺激信號(hào)是在DNA損傷和復(fù)制應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的單鏈DNA(single－strandDNA，ssDNA)。由于伸展的ssDNA對(duì)細(xì)胞是有害的，因而迅速被復(fù)制蛋白A(replicationproteinA，RPA)包裹。保守的ATR－Chk1通路中，ATR通過(guò)其重要結(jié)合伴侶ATR相互作用蛋白(ATRinteractingprotein，ATRIP)被招募于RPA－ss-DNA，9－1－1檢查點(diǎn)鉗(Rad9－Rad1－Hus1checkpointclamp)結(jié)合在DNA斷裂雙鏈和單鏈的連接處并招募介導(dǎo)蛋白TopBP1，介導(dǎo)蛋白Claspin招募Chk1到DNA損傷位點(diǎn)從而使ATR能得以直接磷酸化Chk1，而TopBP1與ATR－ATRIP復(fù)合體及9－1－1檢查點(diǎn)鉗中Rad9發(fā)生相互作用。ATR－ATRIP的完全激活不能由 RPA－ssDNA單獨(dú)實(shí)現(xiàn)，還需要TopBP1的參與。

Kumagai等在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TopBP1極大的增強(qiáng)ATR激酶活性。他們發(fā)現(xiàn)TopBP1與ATR－ATRIP復(fù)合體發(fā)生作用，TopBP1的ATR激活區(qū)(ATR－activatingdomain，AAD)位于第6、7BRCT功能域之間，AAD區(qū)本身足以異位激活A(yù)TR依賴(lài)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而AAD區(qū)的單點(diǎn)突變即可使這一活性消失。Toledo等實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，將異位表達(dá)的AAD區(qū)從胞質(zhì)重置于胞核后足以激活A(yù)TR，在無(wú)DNA損傷的前提下過(guò)表達(dá)AAD區(qū)能夠激活A(yù)TR而促進(jìn)Chk1、H2AX、Rad17等底物的磷酸化。而Liu等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)TopBP1阻止了ATR激酶對(duì)Chk1、Nbs1、H2AX等底物的磷酸化。因此，TopBP1激活A(yù)TR似乎是自然界的普遍現(xiàn)象，ATR使眾多底物磷酸化的活性需要TopBP1來(lái)充分激活。

TopBP1激活A(yù)TR－ATRIP的具體機(jī)制尚不明確，一個(gè)可能機(jī)制是TopBP1類(lèi)似于一個(gè)支架，聯(lián)系眾多蛋白聚集在ATR附近而被ATR磷酸化;另一可能機(jī)制是蛋白的共定位易化了TopBP1和ATRIP的相互作用，這使得TopBP1的AAD區(qū)能夠接觸ATR，誘導(dǎo)了ATR激酶區(qū)構(gòu)象的改變，因而底物能夠被輕易磷酸化，也就是說(shuō)結(jié)合TopBP1后ATR－ATRIP構(gòu)象改變而促進(jìn)激活［4］。TopBP1和ATR－ATRIP之間的相互作用是松散而短暫的，無(wú)TopBP1存在時(shí)ATR只有基本的激酶活性，只有在TopBP1結(jié)合以后ATR－ATRIP才是有活性的。經(jīng)凝膠過(guò)濾使TopBP1從復(fù)合體分離以后，ATR－ATRIP激酶活性又恢復(fù)到初始的較低水平［18］。TopBP1對(duì)ATR的有效激活，是細(xì)胞為了充分應(yīng)對(duì)DNA損傷反應(yīng)而進(jìn)行信號(hào)放大的需要。

TopBP1和ATRIP的接觸易化了TopBP1和ATR之間的相互作用。TopBP1發(fā)生在ATRIP接觸區(qū)的突變削弱了細(xì)胞從復(fù)制應(yīng)激狀態(tài)中恢復(fù)及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的能力，從而使細(xì)胞活性下降。TopBP1與ATR的C末端上的特異性PIKK調(diào)節(jié)區(qū)相互聯(lián)系，發(fā)生在ATR調(diào)節(jié)區(qū)的突變不影響基本的激酶活性，但阻止了激酶的完全激活。ATR強(qiáng)力激活需要1989位蘇氨酸的自磷酸化，它反式發(fā)生于聚集在RPA－ssDNA的ATR－ATRIP復(fù)合體。自磷酸化的1989位蘇氨酸能被TopBP1直接識(shí)別，使TopBP1能夠穩(wěn)定連接到ATR－ATRIP復(fù)合體、有效刺激ATR激酶及起到ATR與底物聯(lián)系的支架作用。因此DNA損傷導(dǎo)致的ATR的完全激活需要RPA－ssDNA、ATR自磷酸化和TopBP1的連續(xù)性驅(qū)動(dòng)。

四、TopBP1在DNA損傷修復(fù)中的活性調(diào)節(jié)

由于與TopBP1的接觸可觸發(fā)ATR的激活，所以細(xì)胞中這兩種蛋白的相互作用時(shí)機(jī)就需要嚴(yán)密控制。9－1－1檢查點(diǎn)鉗能夠調(diào)節(jié)TopBP1與ATR的接觸，經(jīng)387位絲氨酸磷酸化后Rad9結(jié)合TopBP1的第2BRCT功能域并將其引導(dǎo)到ATR－ATRIP的周?chē)?。?xì)胞中TopBP1對(duì)ATR的激活刺激也依賴(lài)于TopBP1結(jié)合到損傷的DNA模板，Choi等研究顯示TopBP1是通過(guò)其C末端，包括AAD區(qū)和第7、8BRCT功能域來(lái)結(jié)合DNA的。

DNA損傷反應(yīng)中 TopBP1非常早就被招募到DNA損傷位點(diǎn)，并激活A(yù)TR激酶作用到幾乎所有ATR靶點(diǎn)?，F(xiàn)已明確在激活A(yù)TR方面并不要求對(duì)TopBP1蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾，因?yàn)檫@種激活也發(fā)生在TopBP1重組體或單獨(dú)AAD區(qū)。但是對(duì)于TopBP1蛋白定位區(qū)域和(或)濃度的不同，也可視為一種修飾調(diào)節(jié)。異位表達(dá)的AAD區(qū)會(huì)缺乏任何DNA結(jié)合活性，但當(dāng)將其從胞質(zhì)移至胞核后，又能夠激活A(yù)TR。所以，在正常細(xì)胞環(huán)境中，控制ATR的激活，可以通過(guò)調(diào)節(jié)TopBP1的定位而實(shí)現(xiàn)，或許也能通過(guò)調(diào)節(jié)溶解蛋白的濃度而實(shí)現(xiàn)。

在招募TopBP1到DNA損傷位點(diǎn)時(shí)存在多層控制機(jī)制:①TopBP1能被信號(hào)識(shí)別蛋白，如Rad9招募到激活位點(diǎn);②早期結(jié)合到DNA損傷位點(diǎn)的Nbs1、53BP1、PARP－1都可能再與TopBP1結(jié)合，從而為T(mén)opBP1結(jié)合到損傷位點(diǎn)提供新途徑;③體外實(shí)驗(yàn)也見(jiàn)TopBP1直接結(jié)合到諸如DNA斷裂、單鏈DNA或大量加合物的DNA損害處［4］。這種招募TopBP1的冗繁機(jī)制是生物體逐漸進(jìn)化中形成的，從而保證當(dāng)基因組遇險(xiǎn)時(shí)維護(hù)基因組保真度的通路能有效激活。

五、TopBP1與乳腺癌的發(fā)生

DNA損傷誘導(dǎo)的DNA修復(fù)和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)功能在抑制腫瘤發(fā)生方面有重要意義，特別是在ATR－Chk1通路上的蛋白出現(xiàn)功能異常后將促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有致癌作用的雌二醇E2和膜相關(guān)雌激素受體α(estrogenreceptorα，ERα)內(nèi)源性抑制了ATR級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)引發(fā)的G2/M檢查點(diǎn)和快速DNA修復(fù)功能，因而更易促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。由于TopBP1蛋白在細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定性，特別是DNA損傷修復(fù)中起重要作用，所以TopBP1基因變異導(dǎo)致的TopBP1功能異常也可能會(huì)增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

Karppinen等在芬蘭125個(gè)家族性乳腺癌和卵巢癌群體中篩查胚系TopBP1基因突變，發(fā)現(xiàn)雜合子Arg309Cys錯(cuò)義突變發(fā)生頻率較健康對(duì)照組高，兩者有明顯的差異(15.2%vs7.0%，P=0.002)。這種變異發(fā)生在TopBP1蛋白N末端接近第2BRCT功能域的進(jìn)化保守序列區(qū)，與大約2倍的乳腺和(或)卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)。但隨后Blaut等在德國(guó)的調(diào)查研究認(rèn)為T(mén)opBP1基因Arg309Cys變異并沒(méi)有增加德國(guó)人患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。因而TopBP1基因多態(tài)性導(dǎo)致乳腺癌方面也存在爭(zhēng)議，這方面的研究還需在更大范圍及更多人種間進(jìn)行。

組織學(xué)研究支持TopBP1蛋白在抑制乳腺癌方面的潛在作用。Going等在未經(jīng)選擇的乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)TopBP1蛋白的異常表達(dá):在普通乳腺組織中TopBP1蛋白主要定位于細(xì)胞核，而在乳腺癌中表達(dá)方式多種多樣，既有核染色、核漿同時(shí)染色，又有單純胞質(zhì)染色。類(lèi)似的結(jié)果也分別見(jiàn)于貓科和犬科動(dòng)物乳腺腫瘤中。既然乳腺癌組織中大多數(shù)的TopBP1過(guò)表達(dá)發(fā)生在胞核，TopBP1因此能影響轉(zhuǎn)錄因子如E2F1、p53等的功能。

腫瘤抑制因子p53蛋白在應(yīng)對(duì)DNA損傷時(shí)控制G1/S檢查點(diǎn)而使細(xì)胞周期阻滯于G1期，而在非應(yīng)激狀態(tài)下p53活性應(yīng)維持在較低水平以利于細(xì)胞正常增殖。大多數(shù)人類(lèi)腫瘤中p53是突變或失活的。Liu等研究發(fā)現(xiàn)TopBP1的缺失上調(diào)了涉及細(xì)胞周期阻滯和凋亡的p53靶基因的活性，這種調(diào)節(jié)由TopBP1的第7、8BRCT功能域和p53的DNA結(jié)合區(qū)介導(dǎo)，抑制了p53的啟動(dòng)子結(jié)合活性。他們的研究顯示TopBP1的過(guò)表達(dá)更易在三陰性乳腺癌中見(jiàn)到，且與較高腫瘤分級(jí)和較短生存時(shí)間相關(guān)。TopBP1過(guò)表達(dá)抑制了p53靶基因的表達(dá)，抑制了DNA損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡和G1期阻滯。因此，生理水平的TopBP1對(duì)正常G1/S期轉(zhuǎn)換是必要的，而腫瘤細(xì)胞中病理水平的TopBP1可能會(huì)擾亂p53功能而使腫瘤表現(xiàn)出侵襲性。

六、展 望

DNA雙鏈斷裂引發(fā)的染色體不穩(wěn)定促使腫瘤易感性增加，修復(fù)過(guò)程錯(cuò)誤是有絲分裂的生長(zhǎng)細(xì)胞產(chǎn)生染色體畸變的主要來(lái)源，這就要求有復(fù)雜的監(jiān)督機(jī)制來(lái)保證正確的DNA修復(fù)重建。TopBP1是重要的蛋白，除參與DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制及DNA修復(fù)功能外，還在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞分裂方面發(fā)揮作用，因而涉及細(xì)胞增殖和凋亡。TopBP1的過(guò)表達(dá)與侵襲性乳腺癌相關(guān)，因而具有治療意義，如將特異性的TopBP1抑制劑用于那些高表達(dá)TopBP1的乳腺癌患者，以重新激活p53依賴(lài)性的凋亡而增加療效。隨著研究的不斷深入，針對(duì)TopBP1這一重要的DNA損傷修復(fù)蛋白的靶向藥物有望研制成功，個(gè)體化的腫瘤預(yù)防和治療手段也將在臨床工作中逐步得到應(yīng)用。

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