方勤

（重慶市涪陵區(qū)義和鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶涪陵 408104）

目前隨著生豬養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展，生豬防疫工作的進一步縱向深化，口蹄疫、豬瘟、高致病性藍耳病等重大疫病免疫逐漸在從重點免疫向全面免疫轉(zhuǎn)變、從季節(jié)性免疫向常年免疫轉(zhuǎn)變、從注重密度向既注重密度又注重質(zhì)量轉(zhuǎn)變。特別是在生豬規(guī)模化養(yǎng)殖場，對于一些傳染性比較強、危害性比較大的疾病，選擇預(yù)防接種已經(jīng)成為防控這類疾病的關(guān)鍵。但是由于疫苗免疫是一個復(fù)雜，影響因素極多的過程，當(dāng)疫苗接種到動物體內(nèi)后，必須要經(jīng)過動物機體本身的一系列復(fù)雜反應(yīng)，機體自身的免疫系統(tǒng)才能夠產(chǎn)生保護力。而這種保護力往往容易受到除了疫苗以及動物機體本身的影響。對于生豬養(yǎng)殖場的免疫程序是不能一層不變的，適合于該場的免疫程序也許經(jīng)過兩三年就會不太適合，必須根據(jù)情況隨時加以調(diào)整。一些養(yǎng)殖場照搬別場免疫程序或連年不變的做法難免會造成失誤而引發(fā)該場發(fā)病，從而造成本區(qū)域內(nèi)生豬疫病的流行。因此，若有條件應(yīng)根據(jù)實驗室監(jiān)測數(shù)據(jù)對養(yǎng)殖場生豬的實際抗體水平為依據(jù)，并結(jié)合當(dāng)?shù)氐膶嶋H情況，制定適合于本場的免疫程序。

豬瘟俗稱“爛腸瘟”，它是由豬瘟病毒引起的一種高度接觸性傳染病。豬瘟病毒（CSFV）屬于黃病毒科豬瘟病毒屬，CSFV為單股正鏈RNA有囊膜病毒。自1833年首次在美國俄亥俄州發(fā)現(xiàn)CSF。近百年以來，一直在全世界范圍內(nèi)流行，也是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。中國自主研制的豬瘟兔化弱毒疫苗在防治CSF過程中具有很重要的作用，但近年來各地生豬養(yǎng)殖場仍有CSF免疫效果不理想的情況出現(xiàn)。

豬瘟抗體檢測的方法很多，基本都是以病毒中和試驗為基礎(chǔ)，目前使用最廣泛的檢測CSF血清抗體的ELISA方法，包括了檢測豬瘟病毒的粗蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，其中使用最廣泛的是CSFV E2 ELISA，即檢測豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E2的ELISA，此次我們用來檢測豬瘟抗體的試劑盒就是使用的這種檢測方法，該檢測方法的特異性能達到99%。E2蛋白是CSFV的一個囊膜糖蛋白，分子量大小為51～58kDa，是豬瘟病毒里三個病毒糖蛋白之一，也是豬瘟病毒的主要抗原蛋白。E2蛋白分子內(nèi)的1 5個Cys殘基屬于E2蛋白的保守區(qū)域，其中N端6個Cys殘基主要參與了抗原蛋白結(jié)構(gòu)域的形成，C端9個Cys殘基則參與同源、異源二聚體的形成，屬于E2蛋白的變異區(qū)域。

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病。FMD主要侵害偶蹄獸，最易感染的動物是黃牛、水牛、豬、駱駝、羊、鹿等；黃羊、麝、野豬、野牛等野生動物也易感染此病。FMD的臨床癥狀是以病畜全身發(fā)熱、口腔黏膜及蹄部和乳房皮膚發(fā)生水泡和潰爛為特征，是國際獸疫局規(guī)定的A類傳染病，易通過空氣傳播，傳染性強、發(fā)病急、危害大等流行特點。FMD傳播無明顯的季節(jié)性，春秋兩季較多。FMDV屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，它有七個血清型且各型之間無交叉保護反應(yīng)。FMDV含有4種結(jié)構(gòu)蛋白，分 別 為 VP1、VP2、VP3和 VP4，其中VP1蛋白上不僅存在著FMDV主要的抗原位點，還含有病毒受體結(jié)合區(qū)。

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的特征是豬群發(fā)生以繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)癥狀的一種急性、高度傳染的病毒性傳染病。高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱藍耳?。┎《咀儺愔暌鸬囊环N急性高致死性疫病。仔豬發(fā)病率可達100%、死亡率可達50%以上，母豬流產(chǎn)率可達30%以上，育肥豬也可發(fā)病死亡是其特征。PRRSV為動脈炎病毒屬的成員，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈球型，直徑為55～60 nm，病毒有2個血清型，即美洲型和歐洲型，我國分離到的毒株為美洲型。

豬偽狂犬?。≒R）是由偽狂犬病毒(PRV)引起的一種傳染病。該病最早發(fā)現(xiàn)于美國，后來由匈牙利科學(xué)家首先分離出病毒。偽狂犬病毒PRV屬于皰疹病毒科豬皰疹病毒屬，病毒粒子為圓形，直徑150～180 nm，核衣殼直徑為105～110 nm。病毒粒子的最外層是病毒囊膜，它是由宿主細胞衍生而來的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)。囊膜表面有長約8～10 nm呈放射狀排列的纖突。偽狂犬病毒V只有一個血清型，但不同毒株在毒力和生物學(xué)特征等方面存在差異。血清學(xué)鑒別診斷豬偽狂犬病病毒的方法，是在使用基因標志疫苗的基礎(chǔ)上應(yīng)用的一類診斷方法。由于PRV中存在多個非心需糖蛋白基因，缺失這些基因的病毒突變株從而不能產(chǎn)生被缺失基因所編碼的糖蛋白，但是缺失的糖蛋白并不能影響病毒在細胞上的增殖與免疫原性。將這種基因缺失標志疫苗注射動物后，動物不能產(chǎn)生針對缺失蛋白的抗體。因此，可通過血清學(xué)方法將自然感染野毒的血清學(xué)陽性豬與注苗豬區(qū)分開來。

一、材料和方法

（一）材料 2011年1月～12月，對本區(qū)的20個大型生豬集約化養(yǎng)殖場，按每個豬場隨機抽選種母豬以及15～45日齡的仔豬各10頭份，每頭份采集全血3～5 ml，并記錄好各養(yǎng)殖場的免疫程序。將編號好的豬血分別移至1.5 ml滅菌EP管內(nèi)，3 000 r/min離心10 min，共計獲得了350份合格樣品血清。根據(jù)養(yǎng)殖場的免疫記錄，此次采樣所抽選豬群均未接種豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬傳染性胸膜肺炎的疫苗，有部分豬場在采樣近一個月內(nèi)曾接種過豬瘟弱毒苗，另外所有豬場均接種過豬口蹄疫及豬偽狂犬病毒活疫苗。

（二）方法

1.豬 瘟。HerdChek豬 瘟 抗體檢測試劑盒（CSFV Ab），有效期至2011年4月30日，購自北京愛德士元亨生物科技有限公司。首先將豬瘟抗體檢測試劑盒恢復(fù)到室溫18℃～25℃，將待檢血清樣品和陰陽性對照血清用樣品稀釋液做1:1倍稀釋（50 μl樣品血清中加入50 μl樣品稀釋液）并加入豬瘟抗體包被板內(nèi)的檢測孔中，輕彈反應(yīng)板，使反應(yīng)板中的溶液混勻，在室溫下（18℃～25℃）孵育2 h，300 μl洗滌液洗板3次后加入辣根過氧化物酶標記（HRPO）的抗豬瘟病毒的酶標抗體后室溫下孵育30 min，洗板顯色后加入終止液，然后在450 nm處測定樣品及對照的吸光度值，并按照試劑盒說明書對樣品血清值進行判斷。

2.豬口蹄疫。豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷試劑盒，有效期至2011年4月，購自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司。試劑盒使用前恢復(fù)至室溫，對血清樣品和陰陽性血清用樣品稀釋液進行1:10倍稀釋后取稀釋后液體加入到抗原包被板內(nèi)的反應(yīng)孔中，將反應(yīng)板放置在37℃下孵育60 min后，用300 μl洗滌液洗滌6次拍干，加入100 μl酶結(jié)合物，37℃孵育30 min后再洗滌一次后加入底物顯色，15 min后加入終止液，然后在450 nm處測定樣品及對照的吸光度值，并按照試劑盒說明書對樣品血清值進行判斷。

3.豬繁殖與呼吸綜合征。LSI豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測試劑盒，有效期至2011年5月，購自上海天之泰生物科技有限公司。試劑盒使用前恢復(fù)至室溫，對血清樣品用樣品稀釋液進行1：200倍稀釋然后取50 μl經(jīng)稀釋后的樣品血清加入反應(yīng)板中（陰陽性對照不用稀釋），蓋上膜，將反應(yīng)板放置在37℃下孵育60 min后，用300μl洗滌液洗滌3次拍干，加入50 μl酶標抗體，37℃孵育60 min后再洗滌一次后加入底物顯色，10 min后加入終止液，然后在450 nm處測定樣品及對照的吸光度值，并按照試劑盒說明書對樣品血清值進行判斷。

4.豬偽狂犬。豬偽狂犬病病毒gpI抗體檢測試劑盒是用于檢測豬血清中偽狂犬病病毒（PRV）gpI（又名gpE）抗體，該檢測試劑盒是用來檢測被檢豬是否曾感染PRV的野毒株和或接種過含gpI（gpE）抗原的疫苗，根據(jù)涪陵區(qū)養(yǎng)殖場實際情況，該試劑盒可用來檢測PRV野毒株的感染情況。豬偽狂犬病毒（PRV）gB抗體檢測試劑盒是用來檢測評估PRV的自然感染或免疫狀況。試驗步驟及試驗結(jié)果分別按照試劑盒要求進行。

二、試驗結(jié)果

（一）豬瘟 對抽選采集的200份生豬血清采用HerdChek豬瘟抗體檢測試劑盒進行豬瘟抗體監(jiān)測，按照試劑盒檢測標準，如果被檢樣品的阻斷率大于或等于40%，該樣品就可以判為陽性（即有CSFV抗體存在），試驗結(jié)果見表1。

（二）豬口蹄疫 對抽選采集的200份生豬血清采用豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷試劑盒，被檢樣品OD值≥0.23X陽性對照平均OD值判為陽性（即有豬口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體存在），試驗結(jié)果見表2。

（三）豬繁殖與呼吸綜合征 對抽選的豬血清進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測，根據(jù)試劑盒說明書上的標準，試驗結(jié)果見表3。

（四）豬偽狂犬病 對抽選的豬血清進行豬偽狂犬病毒gpI（gpE）抗體檢測，按照試劑盒判斷標準200份豬血清樣品抗體全為陰性。對抽選的豬血清進行豬偽狂犬病毒gpB抗體檢測，按試劑盒說明書上的標準，試驗結(jié)果見表4。

三、分析與討論

200份血清樣品中豬瘟抗體為陽性的血清有156份，豬瘟抗體陽性率為78%；豬口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性的血清有176份，豬口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性率為88%；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（高致病性藍耳?。┛贵w陽性的血清有68份，豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性率為34%；豬偽狂犬病病毒gI抗體為陽性的血清有0份，豬偽狂犬病病毒gB抗體為陽性的血清有185份，豬偽狂犬病抗體陽性率92.50%。

按試驗結(jié)果，豬瘟免疫抗體合格率達到100%，仔豬抗體合格率為56%。養(yǎng)豬生產(chǎn)中雖然有質(zhì)量可靠的疫苗用于豬瘟防治，但發(fā)生豬瘟的原因很復(fù)雜，其中免疫時機，特別是初免時間選擇不當(dāng)是重要的原因之一。關(guān)于仔豬出生后其血清中通過母乳獲得豬瘟抗體的多少及維持時問長短等問題，一直是獸醫(yī)工作者所關(guān)心的，很多人作過跟蹤監(jiān)測，其結(jié)果并不具有統(tǒng)一性 。事實上，仔豬血清中的抗體水平高低和維持時間長短受母體、仔豬個體及飼養(yǎng)管理條件諸多因素的影響，不同的監(jiān)測對象有不同的結(jié)果是自然的，也是可以理解的。懷孕母豬豬瘟抗體水平較高時，仔豬通過母乳獲得的抗體是足以抵抗豬瘟病毒侵襲的，并且在哺乳期內(nèi)一直能夠保持較高的抗體水平。一般認為仔豬的母源抗體半衰期為14 d ，從而確定初免時間在仔豬21日齡左右，但在生產(chǎn)實際中，各個單位應(yīng)該結(jié)合自身的實際，及時進行抗體效價的監(jiān)測，從而確定更合理的免疫時機。

表1 涪陵地區(qū)集約化豬場豬瘟血清抗體檢測結(jié)果

表2 涪陵地區(qū)集約化豬場豬口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白血清抗體檢測結(jié)果

表3 涪陵地區(qū)集約化豬場豬繁殖與呼吸綜合征病毒血清抗體檢測結(jié)果

表4 涪陵地區(qū)集約化豬場豬繁殖與呼吸綜合征病毒血清抗體檢測結(jié)果

種豬口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體種豬免疫合格率為100%，仔豬抗體合格率為88%。涪陵區(qū)生豬養(yǎng)殖場豬口蹄疫免疫采取的是二針強制免疫，種豬的免疫抗體效價比仔豬要高。豬偽狂犬病血清抗體檢測結(jié)果，種豬免疫抗體合格率達99%，仔豬抗體合格率達86%。定期監(jiān)測對于偽狂犬病的防控和凈化非常關(guān)鍵，偽狂犬病gE基因缺失疫苗的廣泛應(yīng)用及相配套的gE—ELISA鑒別診斷方法的商品化，為偽狂犬病的凈化和定期監(jiān)測提供了充分的技術(shù)基礎(chǔ)。因此規(guī)?；i場一定要注重豬群偽狂犬野毒抗體和免疫抗體的定期監(jiān)測，gE—ELISA可以監(jiān)測野毒感染，同時野毒陰性豬群通過gE—ELISA 可以及時了解豬場偽狂犬疫苗免疫效果，制定科學(xué)的免疫程序。豬場免疫偽狂犬gE基因缺失疫苗都產(chǎn)生了良好的免疫效果；這些方法和疫苗都可以推廣應(yīng)用，但是為了使豬體免疫力更強，阻止野毒入侵，建議仔豬在首免后，適當(dāng)時間進行二次加強免疫。

此次調(diào)查結(jié)果顯示20個豬場中所采樣品的豬繁殖與呼吸綜合征免疫抗體合格率種豬達到68%，仔豬抗體合格率為34%。豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測結(jié)果中，母豬抗體陽性水平超過仔豬，但仍未達到理想水平，表明養(yǎng)殖場均應(yīng)加強豬繁殖與呼吸綜合征的免疫預(yù)防。豬繁殖與呼吸綜合征有經(jīng)典型和高致病型，疫苗也有經(jīng)典株疫苗和高致病性病毒株疫苗兩種，按照疫苗種類又分為弱毒和滅活疫苗。涪陵區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗除部分場外基本都是采用高致病性病毒株苗，部分生豬養(yǎng)殖場近年來開始使用弱毒苗，從檢測數(shù)據(jù)來看，弱毒苗免疫效果比滅活苗效果要好。據(jù)資料報道，PRRSV即便是在血漿中不存在的情況下，也能在幾個月里長時間感染生豬，而所有的母豬都易感染PRRS。PRRS活疫苗的出現(xiàn)為豬場免疫提供了另一個選擇，但PRRSV變異大，經(jīng)典毒株和高致病毒株免疫交叉保護的效果好壞還未有共識，豬場在弱毒疫苗的選擇上還應(yīng)結(jié)合自身情況考慮毒株。

（略）