金鎮(zhèn)勛 蘭汝春 王 菲 董長松 徐 冶 (吉林醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院消化科，吉林 吉林 3203)

細胞內存在兩種主要的蛋白質降解途徑，泛素-蛋白酶體途徑和自噬途徑，自噬途徑主要降解長壽命蛋白，而泛素-蛋白酶體途徑則主要降解短壽命蛋白，這些蛋白包括一些細胞周期蛋白、轉錄因子、抗腫瘤蛋白和促凋亡蛋白。蛋白酶體廣泛存在于真核細胞中，泛素-蛋白酶體系統是生物體內進行蛋白質選擇性降解的重要途徑之一，泛素-蛋白酶體系統的異常可以導致多種疾病的發(fā)生，其中在腫瘤發(fā)展中的作用越來越受到人們的重視。乳胞素(Lactacystin，LAC)是鏈霉菌屬的代謝產物，可以通過細胞膜，引起不可逆的蛋白酶體抑制〔1〕，被廣泛應用于蛋白酶體的研究中〔2～4〕。本研究通過體外培養(yǎng)BGC-823，觀察自噬抑制劑3-MA對蛋白酶體抑制劑LAC抑制BGC-823細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司;胎牛血清(BSA)、IMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、N，N-二甲基雙丙烯酰胺、過氧化物酶標記二抗購自北京鼎國生物技術有限公司;β-肌動蛋白(β-actin)、細胞色素 C(Cytochrome C)、半胱氨酸蛋白酶-4(caspase-4)抗體購自美國SANTA CRUZ公司。

1.2 實驗分組 分為對照組、3-MA 5 mmol/L組、LAC 5 μmol/L組和 LAC 5 μmol/L+3-MA 5 mmol/L 組。

1.3 MTT法檢測細胞存活率 取處于對數生長期的BGC-823細胞，胰酶消化后800 r/min離心，按每孔含1×104BGC-823細胞加入96孔細胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜使BGC-823細胞完全貼壁。設立對照組以及不同濃度LAC組，每個LAC濃度9個重復孔，LAC作用12 h后每孔加入20 μl MTT，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸掉96孔板中的培養(yǎng)液，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩器振蕩10 min。BIO-TEK酶標儀上，選擇490 nm波長，測定每孔中吸收值，計算細胞增殖率。對照組細胞存活率為100%，加藥各組存活率=(各濃度組A值/對照組A值)×100%。

1.4 Western印跡法檢測各組細胞 β-actin、Cytochrome C、caspase-4蛋白表達水平 (1)蛋白的提?。禾幱趯瞪L期的BGC-823細胞，待細胞生長到培養(yǎng)瓶70%時，隨即將4瓶細胞分為4組，作用12 h后，胰酶消化離心，每瓶加入120 μl預先冷卻的細胞裂解液(RIPA)，混勻，細胞粉碎儀超聲粉碎2次，每次5 s，4℃作用60 min，3 000 r/min離心收集上清。(2)蛋白濃度測定：根據說明書，利用BSA測定各組蛋白濃度。(3)蛋白質的變性：每管加入30 μl 5×上樣緩沖液，煮沸變性。(4)丙烯酰胺凝膠電泳：將每組蛋白緩慢加入加樣孔中，加入電泳液，濃縮膠80 V，25 min;分離膠160 V，45 min。電泳結束后，根據目的蛋白分子量的不同剪切分離膠。轉膜，首先放置1層海綿2層濾紙，然后放入分離膠，聚偏氟乙烯(PVDF)膜，最后上面再放置2層濾紙和1層海綿，放入冰盒，倒入足夠的轉膜液，100 V，55 min。轉膜結束后取出PVDF膜，放入5%脫脂奶粉封閉2 h。封閉結束后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜3次，每次5 min，然后加入相應一抗 (β-actin、Cytochrome C、caspase-4;1∶200稀釋)，4℃冰箱過夜，次日回收一抗，PBS洗膜3次，時間分別為1×15 min、2×5 min，加入過氧化物酶標記的相應二抗(1∶1 000稀釋)搖床搖2 h，二氮基聯苯胺(DAB)顯色。

1.5 統計學分析 采用SPSS12.0統計學軟件，各組之間各項檢測指標比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 單獨應用LAC以及聯合應用3-MA對各組胃癌BGC-823細胞增殖率的影響 MTT結果顯示，與Control組(100%)相比，LAC 5 μmol/L可以引起細胞增殖下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)。同時聯合應用 LAC 5 μmol/L和 3-MA 5 mmol/L可以進一步引起細胞增殖率的下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 各組BGC-823細胞Cytochrome C表達水平 單獨應用蛋白酶體抑制劑LAC可以引起線粒體凋亡相關蛋白Cytochrome C表達水平升高，而聯合應用LAC和3-MA時，Cytochrome C表達水平進一步升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。提示3-MA可以增加LAC引起的線粒體凋亡。見圖1。

2.3 各組BGC-823細胞caspase-4表達水平 單獨應用蛋白酶體抑制劑LAC可以引起caspase-4表達水平的升高，而聯合應用LAC和3-MA時，caspase-4表達水平進一步升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。提示3-MA可以增加LAC引起的內質網介導的凋亡。見圖2。

圖1 各組BGC-823細胞Cytochrome C蛋白表達比較

圖2 各組BGC-823細胞caspase-4蛋白表達比較

3 討論

蛋白質的新陳代謝對于維持正常的細胞功能，促進細胞存活極其重要。泛素-蛋白酶體途徑在降解陳舊蛋白質從而促進蛋白質的新陳代謝中發(fā)揮重要的作用。細胞內蛋白質降解必須由精確的時間和空間來調節(jié)。泛素-蛋白酶體途徑由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)、泛素-蛋白連接酶(E3)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(DUBs)等組成。泛素蛋白酶體對蛋白質的降解是一個連續(xù)的過程〔5〕。E1首先催化泛素使其C-末端甘氨酸殘基與E1的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵而活化?；罨腅1-泛素結合的中間體再將泛素轉移給泛素結合酶E2，從而形成E2-泛素中間體。最后一步，泛素-蛋白連接酶E3與靶蛋白結合，促使泛素分子相繼連接到靶蛋白上，形成一條多泛素鏈〔6〕。如果蛋白質降解出現了異常，將會導致嚴重的細胞生長障礙，包括增殖和分化的障礙，同時，泛素蛋白酶體的異常還可以誘導多種疾病的發(fā)生。蛋白酶體抑制劑LAC通過阻止細胞內20 S蛋白酶體與蛋白起接觸反應的β亞單位，從而有效專一抑制 20S蛋白酶體活性〔7～9〕。

本研究通過體外培養(yǎng)胃癌BGC-823細胞，利用蛋白酶體抑制劑LAC可以明顯地引起B(yǎng)GC-823細胞增殖率的下降，聯合應用自噬抑制劑3-MA可以增加LAC引起的細胞增殖率的下降。本文進一步利用Western印跡方法檢測了線粒體凋亡相關蛋白Cytochrome C以及內質網凋亡相關蛋白caspase-4變化，LAC可以引起線粒體凋亡相關蛋白Cytochrome C以及內質網凋亡相關蛋白caspase-4表達水平升高，當聯合應用自噬抑制劑3-MA時，可以進一步引起Cytochrome C和caspase-4升高，提示3-MA可以增加LAC引起的細胞凋亡。以上結果表明，同時抑制蛋白酶體降解途徑和自噬降解途徑，能更加有效地抑制BGC-823細胞增殖，這一機制為胃癌治療提供了新的思路。

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5 倪曉光，趙 平.泛素-蛋白酶體途徑的組成和功能〔J〕.生理科學進展，2006;37(3)：255-8.

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7 Mukhopadhyay D，Riezman H.Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling〔J〕.Science，2007;315(5809)：201-5.

8 Hao B，Zheng N，Schulman BA，et al.Structural basis of the Cks1-dependent recognition of p27(Kip1)by the SCF(Skp2)ubiquitin ligase〔J〕.Mol Cell，2005;20(1)：9-19.

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