蔡琪敏， 莊靜娜， 魏銀文， 吳寒華，崔宇輝， 曹麗凌， 蔣冬花

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

紅曲菌在我國(guó)已經(jīng)有上千年的應(yīng)用歷史，是我國(guó)寶貴的科學(xué)文化遺產(chǎn)［1］．現(xiàn)代研究表明，紅曲具有降血脂、降血壓、抗氧化、抗癌、抗菌、抗疲勞等多重功效［2］．紅曲菌能產(chǎn)生 Monacolins類、γ-氨基丁酸(GABA)、麥角固醇、色素、淀粉酶等多種生理活性物質(zhì)［3］，在食品、釀酒、制醋、中藥等方面都有著廣泛的用途［4］．從醫(yī)學(xué)角度看，紅曲菌中含有許多值得研究的基因．但迄今為止，對(duì)紅曲菌的研究主要集中在菌種分類與選育、發(fā)酵條件研究、桔霉素檢測(cè)等方面，關(guān)于其分子生物學(xué)方面的研究才剛剛起步，只在紅曲菌分類、DNA文庫(kù)構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化體系建立、Monacolin K和桔霉素代謝調(diào)控途徑相關(guān)基因的研究等方面取得了一定的進(jìn)展［5-9］，對(duì)紅曲菌的遺傳背景知識(shí)了解很少，對(duì)紅曲菌的形態(tài)分化、發(fā)育及次生代謝相關(guān)基因信息的報(bào)道也很少．

本實(shí)驗(yàn)以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅曲菌突變體庫(kù)中538株轉(zhuǎn)化子菌株為材料，通過菌落形態(tài)觀察并結(jié)合顯微特征分析，篩選轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行分子驗(yàn)證和穩(wěn)定性檢測(cè)，并檢測(cè)了紅曲菌中的主要代謝產(chǎn)物紅曲色素和γ-氨基丁酸(GABA)，以期為今后研究紅曲菌代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

出發(fā)菌株：紫色紅曲菌(Monascus purpureus)S菌株，由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏;

突變菌株：538株轉(zhuǎn)化子菌株來自本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的紅曲菌T-DNA插入突變庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室保藏．

1．2 突變體庫(kù)的構(gòu)建

采用實(shí)驗(yàn)室建立的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅曲菌的高效轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建突變體庫(kù)：紅曲菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d后收集孢子，制備紅曲菌孢子懸浮液，孢子濃度為106個(gè)/mL，根癌農(nóng)桿菌溶液的A600為0．5，誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(AS)的濃度為100 μmol/L，農(nóng)桿菌與紅曲菌在25℃共培養(yǎng)3 d．

1．3 轉(zhuǎn)化子的篩選

將轉(zhuǎn)化子活化后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7～14 d，與出發(fā)菌株S比較，根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色和生長(zhǎng)速度等特征，挑選變異明顯的轉(zhuǎn)化子，拍照，保存?zhèn)溆茫?/p>

1．4 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性的分析

將隨機(jī)挑選的20株紅曲菌轉(zhuǎn)化子用無菌牙簽挑取菌絲接種到不含潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7 d．連續(xù)轉(zhuǎn)接6次后，再轉(zhuǎn)接到含潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，同時(shí)接種出發(fā)菌株S作為對(duì)照，30℃培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)，并計(jì)算其穩(wěn)定性．計(jì)算公式為：轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性

1．5 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

1．5．1 轉(zhuǎn)化子基因組DNA的提取

將轉(zhuǎn)化子菌株接種于PDA培養(yǎng)基上活化，按2%的接種量接入裝有40 mL PDA培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d．過濾收集菌絲體，洗滌，用濾紙及吸水紙盡量吸干水分．取適量菌絲樣品于研缽中，加液氮快速研磨成粉末．采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取基因組 DNA［10］．

1．5．2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

根據(jù)pATMT1上的潮霉素基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物HygS1和HygA1，序列為：5'-ATGCCTGAACT CACCGCGAC-3'，5'-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3'，50 μL 體系中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增．PCR 程序?yàn)?4℃ 3 min后進(jìn)入循環(huán)：94℃ 20 s，58℃ 60 s，72℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min．電泳檢測(cè)，拍照記錄．

1．6 轉(zhuǎn)化子菌落與顯微形態(tài)的觀察

將活化后的轉(zhuǎn)化子接種到PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7～14 d，觀察菌落形態(tài)特征．根據(jù)文獻(xiàn)［11］的方法對(duì)供試菌株進(jìn)行觀察和描述．

用接種環(huán)挑取轉(zhuǎn)化子的菌絲，制成玻片，在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化子的顯微特征．

1．7 轉(zhuǎn)化子紅曲色素的分析

將轉(zhuǎn)化子菌株接種于PDA培養(yǎng)基上活化，按2%接種量接入培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d．取培養(yǎng)液加95%乙醇溶液，4℃，8 000 r/min離心15 min，取上清液，稀釋，以相同處理(加95%乙醇溶液)的不接入紅曲菌的培養(yǎng)液為空白對(duì)照，測(cè)定300～600 nm波長(zhǎng)下的吸光度，分析吸收峰值．色價(jià)(U/mL)=稀釋倍數(shù)×吸光度．

1．8 轉(zhuǎn)化子γ-氨基丁酸(GABA)產(chǎn)量的研究

將轉(zhuǎn)化子菌株接種于PDA培養(yǎng)基上活化，按2%接種量接入培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h．采用改良紙色譜法［12］，測(cè)定520 nm處的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，計(jì)算 γ-氨基丁酸(GABA)的產(chǎn)量．

2 結(jié)果與分析

2．1 突變體庫(kù)的構(gòu)建

采用實(shí)驗(yàn)室建立的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅曲菌的高效轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建突變體庫(kù)，共獲得538株轉(zhuǎn)化子．

2．2 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性

將538株轉(zhuǎn)化子接種到PDA培養(yǎng)基上，隨機(jī)挑選20株突變株進(jìn)行穩(wěn)定性研究．結(jié)果顯示，連續(xù)轉(zhuǎn)接6次后，對(duì)照菌株不能生長(zhǎng)，而20株轉(zhuǎn)化子菌株均能在含有100 μg/mL潮霉素的PDA培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，其遺傳穩(wěn)定性高達(dá)100%，比文獻(xiàn)［8］中的高，表明潮霉素抗性基因已經(jīng)整合到紅曲菌基因組中并能穩(wěn)定遺傳．

2．3 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

如果根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的T-DNA成功轉(zhuǎn)移到紫色紅曲菌基因組DNA中，1 106 bp就能擴(kuò)增出潮霉素基因特征條帶，據(jù)此可以鑒定T-DNA是否成功插入到紅曲菌基因組中．

隨機(jī)選取9株具有代表性的轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行PCR鑒定，并與出發(fā)菌株S比較，結(jié)果見圖1．這9株供試菌株在1 000 bp左右均有條帶，且條帶清晰、無雜帶，說明T-DNA已經(jīng)插入到紫色紅曲菌基因組DNA中．

圖1 紅曲菌轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

2．4 轉(zhuǎn)化子的形態(tài)

2．4．1 菌落形態(tài)

將538株轉(zhuǎn)化子接種到PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7 d，比較轉(zhuǎn)化子菌株與出發(fā)菌株S在菌落形態(tài)、顏色等方面的差異．結(jié)果表明，大部分轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株差別不大，只有少數(shù)轉(zhuǎn)化子發(fā)生了較大變化．選取有代表性的9株轉(zhuǎn)化子菌株與出發(fā)菌株一起觀察，其菌落特征見表1和圖2．

2．4．2 顯微形態(tài)

將9株轉(zhuǎn)化子菌株與出發(fā)菌株S在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，挑取菌絲制成玻片，在顯微鏡下觀察形態(tài)特征．結(jié)果如圖3所示：出發(fā)菌株S的菌絲呈透明膠管狀，隔膜清晰，分生孢子與子囊孢子均較多;轉(zhuǎn)化子S25的菌絲透明且細(xì)小，隔膜不明顯，孢子很少;轉(zhuǎn)化子S18，S29和S30的菌絲中色素顆粒均較多，呈現(xiàn)紅色，不透明，但S29的孢子很少，S30的隔膜清晰，S18與S29的隔膜不清晰;轉(zhuǎn)化子S32和S36的菌絲纖細(xì)透明，分生孢子較多，但S36的菌絲形狀不規(guī)則，旁枝很多;轉(zhuǎn)化子S34的菌絲干凈透明，隔膜明顯;轉(zhuǎn)化子S41和S55的菌絲中內(nèi)容物均較多，前者菌絲中多為色素顆粒，后者菌絲中其他內(nèi)容物居多，且前者的菌絲變異較多．

表1 9株代表性轉(zhuǎn)化子菌株的菌落形態(tài)

2．5 轉(zhuǎn)化子紅曲色素的變化

圖3 9株代表性菌株的顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)

將紅曲菌菌株的乙醇浸提液適當(dāng)稀釋后，于300～600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，每個(gè)轉(zhuǎn)化子菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)．由表2可見，紅曲菌轉(zhuǎn)化子的紅曲色素不僅色價(jià)發(fā)生了變化，而且吸收波長(zhǎng)也發(fā)生了不同程度的變化．如：出發(fā)菌株S的吸收峰Ⅰ和吸收峰Ⅱ分別為415和495;而色價(jià)明顯下降的S18的吸收峰Ⅰ變?yōu)?90，吸收峰Ⅱ沒變．原因可能是轉(zhuǎn)化子的色素代謝途徑發(fā)生了某些變化，使色素的組成發(fā)生了改變，這對(duì)色素相關(guān)基因的研究有重要意義．

2．6 轉(zhuǎn)化子γ-氨基丁酸(GABA)產(chǎn)量的變化

轉(zhuǎn)化子菌株與出發(fā)菌株中GABA含量的紙色譜見圖4．圖4顯色明顯，拖尾現(xiàn)象與背景干擾等情況較少．由圖4可以清楚地看出轉(zhuǎn)化子菌株在GABA含量上的差異，在同樣是5 μL上樣量的情況下，轉(zhuǎn)化子菌株 S18，S25，S30，S32，S36，S41和S55的GABA含量與出發(fā)菌株S相比有明顯的升高，S18和S32更是達(dá)到1 g/L以上．

表2 9株代表性轉(zhuǎn)化子紅曲色素的變化

圖4 9株代表性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液中GABA的紙色譜分析結(jié)果

9株轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株S的GABA含量的分析結(jié)果見表3．

表3 9株代表性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液中GABA含量的變化

3 討論

T-DNA插入到紅曲菌基因組之后，會(huì)影響某些基因的表達(dá)，從而引起突變，這些變化將會(huì)表現(xiàn)在各個(gè)方面，形態(tài)突變是比較直觀的方面，而菌落形態(tài)等的直觀變化又常常和其他的重要改變，如次級(jí)代謝產(chǎn)物的變化相關(guān)聯(lián)［13］．

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與出發(fā)菌株相比，轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)發(fā)生的變異主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：菌落大小、菌落顏色、氣生菌絲形態(tài)、菌體產(chǎn)孢子能力、菌落發(fā)生隆起突變、出現(xiàn)輻射紋或裂紋等．

微生物的次級(jí)代謝是指在一定的生長(zhǎng)時(shí)期(通常在后期)，以初級(jí)代謝物質(zhì)為前體，合成一些對(duì)微生物的生命活動(dòng)無明確功能的物質(zhì)的過程．次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與相關(guān)酶催化的代謝途徑有關(guān)，它們多數(shù)是菌株所特有的性質(zhì)［14］．紅曲菌在生長(zhǎng)過程中能產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物．盡管有學(xué)者對(duì)紅曲菌部分代謝產(chǎn)物做了研究，如法國(guó)的Hajjaj等的研究表明紅曲菌產(chǎn)桔霉素與紅曲色素的代謝途徑的起點(diǎn)相同［15］，但是紅曲菌的各種次級(jí)代謝過程及代謝途徑尚不清楚．

本實(shí)驗(yàn)從538株轉(zhuǎn)化子中挑選了9株代表性菌株，主要對(duì)9株轉(zhuǎn)化子菌株與出發(fā)菌株的紅曲色素與γ-氨基丁酸(GABA)的分泌能力進(jìn)行了分析研究，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子不同代謝產(chǎn)物的分泌能力均發(fā)生了不同程度的變化，推測(cè)可能是T-DNA插入紅曲菌基因組阻斷了不同的調(diào)控途徑或代謝途徑所致．

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