楊 敏 林煥冰 張金桃 曾永梅 陳佩瑜 耿嵐嵐 龔四堂

炎癥性腸病(IBD)是指原因不明的一組非特異性慢性復(fù)發(fā)性胃腸道炎癥性疾病。目前應(yīng)用于臨床的生物制劑如抗-TNF 抗體(Infliximab、Adalimumab)及抗黏附分子抗體(Tysabri)，雖然治療IBD 療效肯定，但其價格昂貴，且有誘發(fā)腫瘤和感染可能。因此，開發(fā)有效、低毒及低成本的IBD治療藥物，備受研究者們的關(guān)注。中醫(yī)益氣健脾方劑有增強胃腸黏膜屏障功能、促進黏膜防護因子表達等作用。組方中主要成分黃芪，其主要有效成分黃芪多糖(APS)可誘導多種細胞分化。本研究組前期利用人類全基因組表達譜基因芯片亦證實APS 可調(diào)控K562 細胞的增殖分化［1］;篩選出高表達的轉(zhuǎn)錄因子NFATC4，在APS 調(diào)控細胞增殖分化中發(fā)揮重要作用，可能是參與APS 調(diào)控K562 細胞增殖分化的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究以三硝基苯磺酸(TNBS)誘導IBD 大鼠模型，觀察APS 對模型大鼠受損腸黏膜的修復(fù)作用，NFATC4 在結(jié)腸組織的表達，驗證NFATC4 在APS 治療IBD 中的分子靶點作用，探討APS 維持及修復(fù)上皮屏障功能的作用機制，為臨床治療IBD 提供新的選擇。

1 方法

1.1 實驗動物SD 大鼠 SPF 級，體重(200 ±20)g，雄性，無菌環(huán)境飼養(yǎng)。南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 IBD 大鼠模型的建立 采用TNBS 誘導法，簡述如下:取成年健康雄性SD 大鼠，造模前禁食24 h，自由飲水，10%水合氯醛(300 mg·kg－1)麻醉后用直徑2.0 mm、長約12 cm 的硅膠管從肛門輕緩插入，深約8 cm，將150 mg·kg－1TNBS(3 mL·kg－1，即配成50 mg·mL－1)的50%乙醇溶液緩慢推入結(jié)腸，誘導IBD 形成。為確保注入的TNBS 能夠在大腸內(nèi)彌散分布，注入后將大鼠尾巴提起，持續(xù)倒置1 min。灌腸后24 h 大鼠出現(xiàn)懶動、厭食、腹瀉和黏液血便。

1.3 試劑 注射用APS(天津賽諾制藥有限公司，批號110502);NFATC4 ELISA 試劑盒(ADL 公司，美國)。

1.4 分組 將45 只大鼠隨機分為5 組，每組各9 只:假手術(shù)組(建模時僅給予50%乙醇溶液)、IBD 模型組(不予APS 干預(yù))、APS 低劑量組(100 mg·kg－1)、APS 高劑量組(200 mg·kg－1)和地塞米松對照組(地塞米松0.3 mg·kg－1，0.333 mg·mL－1)。建立IBD 模型后48 h 各組予腹腔注射相應(yīng)藥物，每日1 次，給藥7 d。

1.5 樣品制備 乙醚麻醉下處死大鼠，截取自肛門向上8 cm 結(jié)腸，沿系膜縱行剪開，冰PBS 沖洗干凈，肉眼評估結(jié)腸黏膜損傷程度。在新鮮結(jié)腸標本上沿腸系膜緣及對側(cè)縱向取長約1.5 cm、寬0.3 cm 腸壁組織2 塊。蘇木精-伊紅染色，光鏡下判斷黏膜損傷，進行損傷病理學分度。取病理學標本后剩余結(jié)腸組織即刻放入凍存管置于液氮中保存。

1.6 結(jié)腸黏膜形態(tài)學評分方法 本文第一作者依據(jù)文獻［2］的方法進行評分，為5 級評分(0 ～4 分)，其中0 分為黏膜無損傷，4 分為黏膜損傷程度最重。

1.7 結(jié)腸黏膜損傷病理學分度 由廣州市婦女兒童醫(yī)療中心病理科專人依據(jù)文獻［3］的方法進行病理學分度，包括急性炎癥細胞浸潤、慢性炎癥細胞浸潤、絲素蛋白沉積、黏膜下層水腫、上皮細胞壞死和上皮組織潰瘍6 項，每項為2 級或3 級評分。

1.8 ELISA 測定結(jié)腸組織NFATC4 蛋白含量 按ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.9 實時PCR 法檢測結(jié)腸組織NFATC4 mRNA 表達 結(jié)腸組織提取總RNA 和合成cDNA，采用實時PCR 法檢測NFATC4 mRNA 表達，以β-actin 為內(nèi)參，引物見表1。目的基因的Ct 值與β-actin 的Ct 值的差值△Ct，以2－△Ct 作為相對含量進行分析。實時定量PCR 法擴增曲線圖和熔解曲線見圖1。

表1 引物序列、循環(huán)條件、實時PCR 基因擴增長度Tab 1 Sequences of primer，conditions of PCR and the length of product with real time PCR

1.10 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，方差齊性多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSK 法;方差不齊時采用秩和檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 APS 對大鼠結(jié)腸形態(tài)學評分的影響 大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學肉眼評分為:假手術(shù)組0 分、IBD 模型組(5.67 ±0.87)分、APS 低劑量組(3.56 ±0.89)分、APS 高劑量組(1.56 ±0.53)分、地塞米松對照組(0.89 ± 0.78)分，組間差異總體上有統(tǒng)計學意義(F=69.195 ，P=0.000)。與假手術(shù)組比較，IBD 模型組形態(tài)學評分顯著增高(P ＜0.001);與IBD 模型組比較，APS 高劑量組、APS 低劑量組與地塞米松對照組形態(tài)學評分顯著降低(P 均＜0.001)。

圖1 實時定量PCR 法檢測結(jié)腸組織NFATC4 mRNA 擴增曲線圖和熔解曲線圖Fig 1 Diagrams of amplication cure and melting cure with real time PCR

2.2 APS 對結(jié)腸黏膜病理損傷的影響 病理學評分:假手術(shù)組(0.11 ± 0.08)分、IBD 模型組(5.67 ±1.15)分、APS低劑量組(3.33 ±0.58)、APS 高劑量組(1.33 ±1.15)分、地塞米松對照組(1.67 ±1.52)分，組間差異總體上有統(tǒng)計學意義(F =13.34，P =0.001)。與假手術(shù)組比較，IBD 模型組病理學評分顯著提高(P ＜0.001);與IBD 模型組比較，APS 高劑量組、APS 低劑量組與地塞米松對照組病理學評分顯著降低(P 均＜0.001)。組織病理學檢查顯示，假手術(shù)組可見正常的黏膜結(jié)構(gòu)(圖2A);IBD 模型組可見潰瘍，組織明顯水腫，出血，大量的炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主(圖2B);APS 低劑量組潰瘍少見，組織輕度水腫，炎性細胞浸潤(圖2C);APS 高劑量組及地塞米松對照組見愈合的潰瘍組織，組織水腫及出血明顯減輕，炎性細胞明顯減少(圖2D 和E)。

圖2 各組大鼠光鏡下結(jié)腸黏膜所見(蘇木精-伊紅染色，×200)Fig 2 The colonic mucosal pathological pictures under the light microscope(HE stain，×200)

2.3 APS 對結(jié)腸組織NFATC4 表達的影響 如圖3A 所示，各組間結(jié)腸黏膜NFATC4 mRNA 的表達差異總體上有統(tǒng)計學意義(F =9.7，P =0.000)。與假手術(shù)組比較，IBD模型組NFATC4 mRNA 表達顯著增加(P =0.002);與IBD模型組比較，APS 高劑量組、APS 低劑量組與地塞米松對照組NFATC4 mRNA 表達顯著增加(P 均＜0.001)。

2.4 APS 對結(jié)腸組織NFATC4 蛋白表達的影響 如圖3B所示，各組間結(jié)腸黏膜NFATC4 蛋白的表達差異總體上有統(tǒng)計學意義(F=21.87，P=0.000)。與假手術(shù)組比較，IBD模型組NFATC4 蛋白表達無顯著變化(P =0.203);與IBD模型組比較，APS 高劑量組與地塞米松對照組NFATC4 蛋白表達顯著增加(P 均＜0.001)。

圖3 APS 對結(jié)腸組織NFATC4 mRNA 和蛋白表達的影響Fig 3 The effect of APS on NFATC4 mRNA and protein expression in colon

3 討論

IBD 的發(fā)病機制可能與黏膜免疫系統(tǒng)激活、腸上皮黏膜屏障、炎性細胞因子產(chǎn)生及遺傳易感性相關(guān)。腸上皮屏障損傷與修復(fù)貫穿于IBD 的整個過程，是IBD 發(fā)病機制中的中心環(huán)節(jié)［4］。因此，觀察腸黏膜的損傷、修復(fù)以及腸上皮細胞的增殖與分化，對研究腸上皮屏障功能及IBD 的治療有重要意義。TNBS 誘導的IBD 動物模型，其結(jié)腸組織學改變的許多特點與人類IBD 相似。該模型持續(xù)時間較長，慢性炎癥表現(xiàn)突出，體現(xiàn)急性炎癥向慢性轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程，簡單易行，易于復(fù)制，為研究炎癥慢性化、探索藥物治療創(chuàng)造了條件。

黃芪中的有效成分APS 不僅對機體有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，還可誘導多種細胞增殖分化［5］、調(diào)控細胞周期與細胞凋亡。本研究從肉眼形態(tài)學發(fā)現(xiàn)，與IBD 模型組比較，APS 高劑量組、APS 低劑量組與地塞米松對照組結(jié)腸形態(tài)學評分顯著降低，主要表現(xiàn)有上皮組織糜爛及潰瘍減少，組織水腫減輕。病理學分析發(fā)現(xiàn)，與IBD 模型組比較，APS 高劑量組、APS 低劑量組與地塞米松對照組的病理學評分顯著降低，主要表現(xiàn)為浸潤的急慢性炎癥細胞、壞死的上皮細胞及上皮組織形成潰瘍減少。因此，APS 有減少IBD 模型大鼠結(jié)腸組織的炎性細胞浸潤，修復(fù)受損的結(jié)腸黏膜，并促進潰瘍愈合作用。

NFATs 是嚴格控制適應(yīng)性免疫T 細胞和B 細胞對促炎細胞因子表達的至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與T 細胞、B 細胞激活，趨化因子和細胞因子介導的炎癥反應(yīng)，調(diào)控細胞增殖及凋亡。隨著對NFATs 認識的增多，發(fā)現(xiàn)其不僅表達于免疫系統(tǒng)，亦在食道和小腸上皮、心血管、腦、肺和脂肪等多種組織表達，可調(diào)控多種細胞的增殖與分化［6，7］。本課題組前期研究證實NFATC4 在K562 細胞中表達;基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)，APS 誘導后的NFATC4 表達倍數(shù)顯著增高，推測NFATC4 可能是APS 誘導K562 細胞增殖分化的重要的轉(zhuǎn)錄因子。本研究發(fā)現(xiàn):①正常結(jié)腸組織可表達NFATC4;②IBD 模型組結(jié)腸組織NFATC4 mRNA 表達較假手術(shù)組增高，推測可能的原因是IBD 慢性炎癥啟動了機體對抗損傷黏膜的修復(fù)機制，NFATC4 mRNA 表達增加，促進腸上皮細胞的增殖與分化;③APS 干預(yù)后，APS 低劑量組與APS 高劑量組的NFATC4 mRNA 表達均比IBD 模型組顯著增高，表明APS 可誘導IBD 結(jié)腸組織NFATC4 mRNA 高表達，推測NFATC4 可能參與結(jié)腸上皮細胞的增殖分化的調(diào)控，以修復(fù)受損的腸屏障功能。在蛋白水平上，僅APS 高劑量組NFATC4 蛋白表達增加。NFATC4 對APS 調(diào)控結(jié)腸上皮細胞增殖分化是否存在劑量依賴性，有待進一步研究。

多味中藥組成的方劑是一個包含多種復(fù)雜化學成分的群體，通過多系統(tǒng)、多靶點和多層次作用于人體發(fā)揮其治療作用，往往不能被一個或幾個模型和指標所反映，導致難以進行藥物作用機制的深入研究。而單味中藥及其有效成分的研究是方劑研究和深入進行有效成分分離提取的前提，也是新藥研制必不可少的重要依據(jù)。本研究結(jié)果提示NFATC4 可能在APS 治療IBD 中起到分子靶點的作用，但APS 對IBD 維持和修復(fù)腸黏膜上皮的屏障功能、NFATC4表達調(diào)控、腸上皮細胞增殖與分化三者之間的相互作用機制尚不明確，有待進一步的研究。

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