何海旺 ，許春燕 ，李 文 ，李創(chuàng)珍 ，韋善清 ，何龍飛

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530005；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，南寧 530007）

常規(guī)的甘蔗加繁，繁殖系數(shù)低，1年僅增加種量15～20倍，極大地限制了甘蔗新品種的迅速推廣和應(yīng)用[1]。利用甘蔗組培技術(shù)，實(shí)現(xiàn)工廠化育苗，已成為快速繁殖推廣應(yīng)用甘蔗良種的有效途徑[2]。同時(shí)，甘蔗組培技術(shù)作為一種有效的脫毒技術(shù)[3-7]，它可以把蔗株上的花葉病、宿根矮化病等用常規(guī)方法難以防治的病害減弱，生產(chǎn)健康種苗用于生產(chǎn)，增產(chǎn)增糖效果明顯。甘蔗品種“粵糖55號(hào)”是由廣州甘蔗糖業(yè)研究所湛江甘蔗研究中心于2007年以粵農(nóng)73-204為母本、CP72-1210為父本進(jìn)行雜交選育而成的甘蔗新品種[8]。該品種屬早中熟品種，萌芽快而整齊，萌芽率高，分蘗力強(qiáng)，前中期生長(zhǎng)快，中后期生長(zhǎng)穩(wěn)健，植株高，中至中大莖，莖數(shù)多，粗生耐旱，抗風(fēng)力較強(qiáng)，宿根發(fā)株早而多，宿根性強(qiáng)，可保留4～5年宿根。經(jīng)試驗(yàn)，粵糖55號(hào)甘蔗11—12月平均含蔗糖分為15.23%，比ROCl0甘蔗品種高1.02%（絕對(duì)值，下同），比ROCl6甘蔗品種高0.57%[8]?；浱?5號(hào)適宜廣東、廣西、云南、海南等地力中等的旱坡地、山坡地或山地推廣種植。2009年引種到廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)科研基地種植，生長(zhǎng)表現(xiàn)良好，有良好的推廣應(yīng)用前景。本研究對(duì)甘蔗品種“粵糖55號(hào)”的離體快速繁殖技術(shù)進(jìn)行了研究，旨在為生產(chǎn)該品種的健康種苗，加快該品種在廣西推廣應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以“粵糖55號(hào)”作為試驗(yàn)的品種，取生長(zhǎng)至1m左右的甘蔗莖桿，將其切成長(zhǎng)2cm、寬1cm、厚0.5cm帶腋芽的小塊作為外植體。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)用到的培養(yǎng)基的成分見(jiàn)表1，所有培養(yǎng)基的pH值均為5.8。所有材料接種后均置于實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度為28±2℃，光照強(qiáng)度為2000lx，每天光照12h。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 外植體的消毒及啟動(dòng)培養(yǎng)

將切好的外植體在自來(lái)水下沖洗10min，再用70%酒精浸泡30s，倒去酒精，加入0.1%HgCl2表面消毒7min后，用無(wú)菌水沖洗4次，將表面的HgCl2沖洗干凈。消毒的外植體在啟動(dòng)培養(yǎng)基（表1）上培養(yǎng)7d后，調(diào)查其污染率。在本實(shí)驗(yàn)中，接種的外植體個(gè)數(shù)為96，其中有34個(gè)外植體被污染，污染率為35.4%。

外植體在啟動(dòng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d后，外植體上的腋芽開(kāi)始萌發(fā)，本實(shí)驗(yàn)共接種的外植體個(gè)數(shù)為62個(gè)，有3個(gè)褐化死亡，其余的全部萌芽，萌芽率為95.2%。萌發(fā)的腋芽生長(zhǎng)至1cm左右時(shí)，將其從外植體上切下，接到啟動(dòng)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)30d，將從芽的周圍長(zhǎng)出叢生芽。

2.2 繼代培養(yǎng)

把叢生芽切成單芽接種到繼代培養(yǎng)基（表1）上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)30d后進(jìn)行觀察，記錄繼代苗的各項(xiàng)指標(biāo)。在我們前期的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)6-BA濃度為2.5mg/L時(shí)，與不同濃度的NAA（0.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L）搭配，分別得到的繁殖系數(shù)為：5.89、5.55、5.45，3個(gè)不同的NAA濃度處理間未達(dá)到顯著水平。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了6-BA的濃度梯度，從中篩選出合適的6-BA濃度。從表2的結(jié)果可以看出，隨著6-BA濃度的增高，繼代苗的繁殖系數(shù)先升高，后降低，呈現(xiàn)一個(gè)明顯的拋物線規(guī)律，當(dāng)6-BA濃度為1.0mg/L時(shí)，繁殖系數(shù)達(dá)最高。繼代苗的高度隨著6-BA的濃度升高而明顯降低，培養(yǎng)基中不含6-BA時(shí)最高，已超過(guò)培養(yǎng)容器的高度，但繼代苗太高，容易引起營(yíng)養(yǎng)的消耗及污染，太低則苗的質(zhì)量太差，因此，應(yīng)適當(dāng)控制苗的高度。根據(jù)實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，繼代苗的高度為3～5cm最為合適。隨著6-BA濃度的增加，葉片數(shù)迅速增加，當(dāng)其濃度為4.0mg/L時(shí)，在周圍長(zhǎng)了大量松散的葉片而沒(méi)有有效芽（高度≥1cm的芽）的分化。由以上分析可知，甘蔗品種“粵糖55號(hào)”組培苗繼代的培養(yǎng)基中6-BA濃度為1.0mg/L最合適。

2.3 誘導(dǎo)生根

把3～5cm高的繼代苗叢生芽切成單芽，接種到生根培養(yǎng)基（表1）上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)30d后調(diào)查甘蔗組培苗的生根數(shù)和根長(zhǎng)。根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中6-BA的存在，將會(huì)明顯抑制根的分化，6-BA濃度為0.7mg/L時(shí)，NAA濃度從1mg/L提升到4.3mg/L均不能誘導(dǎo)生根。在沒(méi)有6-BA的條件下，NAA促進(jìn)甘蔗組培苗生根，在0.0～4.0mg/L的NAA濃度范圍內(nèi)，生根數(shù)和根長(zhǎng)都呈先升高后降低的趨勢(shì)。NAA濃度為2.0mg/L或3.0mg/L時(shí)，生根數(shù)和根長(zhǎng)與其他濃度差異極顯著，2.0mg/L時(shí)最高，平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)分別為34.50條、3.84cm（表3）。因此，在甘蔗品種“粵糖55號(hào)”組培苗生根過(guò)程中，使用含2.0mg/L NAA的MS培養(yǎng)基最合適。

2.4 煉苗移栽

甘蔗組培苗經(jīng)生根誘導(dǎo)30d后，苗高大約為9cm，將其移到室外，在自然散射光下進(jìn)行煉苗7d，將組培苗從瓶?jī)?nèi)取出，用自來(lái)水沖掉培養(yǎng)基，移到用木糠作基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)杯中進(jìn)行假植，淋足定根水，假植的成活率為90%～95%。假植30d左右，待甘蔗組培苗長(zhǎng)出新根新芽后，連基質(zhì)一起移栽到大田，成活率達(dá)100%。

3 討論

甘蔗是一種含多元酚類較高的作物，尤其是幼嫩莖尖和嫩葉鞘含量更高。在進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，制備外植體和繼代過(guò)程中細(xì)胞受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的多元酚類化合物與多酚氧化酶接觸，將酚氧化成棕色的對(duì)細(xì)胞有害的醌類物質(zhì)，醌類富集越多，顏色越深，褐化越嚴(yán)重，細(xì)胞正常生理受到破壞就越嚴(yán)重，嚴(yán)重時(shí)還通過(guò)擴(kuò)散污染培養(yǎng)基，這就是所謂的酚為害或酚污染[9]。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，酚污染在整個(gè)組培過(guò)程中均存在。啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)，外植體的體積太小，則容易受酚污染為害而褐化死亡，增加外植體塊的體積能明顯地減輕酚污染對(duì)腋芽的為害，但外植體太大，則會(huì)增加外源菌的污染機(jī)率。本實(shí)驗(yàn)采用長(zhǎng)2cm、寬1cm、厚0.5cm帶腋芽的小塊作外植體比較合適。繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酚為害也會(huì)對(duì)甘蔗組培苗的組織分化與生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響，但在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未對(duì)酚污染進(jìn)行處理的條件下，仍能獲得較高的繁殖系數(shù)及健壯的組培苗。因此，利用莖尖脫毒快繁甘蔗健康種苗時(shí)，酚為害主要在外植體誘導(dǎo)叢生芽時(shí)，而合適的外植體有利于降低酚為害，而在繼代和生根時(shí)影響不大。

據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)[6，10-13]，大多有關(guān)甘蔗組培快繁中的繼代培養(yǎng)基（增殖培養(yǎng)基）均采用6-BA與NAA搭配使用，并且認(rèn)為，當(dāng)6-BA與NAA同時(shí)存在時(shí)，組培苗增殖苗數(shù)較多，但根據(jù)我們前期的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看，這兩種激素搭配使用時(shí)，NAA濃度對(duì)甘蔗品種“粵糖55號(hào)”組培苗的繼代培養(yǎng)影響未達(dá)顯著水平，因此，建議在只含有6-BA的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。賢武等[7]報(bào)道，桂糖26號(hào)脫毒苗的芽增殖率隨著6-BA（1.5～2.5 mg/L）濃度的增加而提高。許莉萍等[14]報(bào)道，6-BA為5.0 mg/L處理在培養(yǎng)50 d后仍未見(jiàn)叢生芽，而2.0 mg/L的處理最早產(chǎn)生叢生芽。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道基本一致，即在6-BA濃度在一定范圍內(nèi)促進(jìn)芽的分化，但高濃度反而降低芽的分化，最適合甘蔗品種“粵糖55號(hào)”誘導(dǎo)叢生芽增殖的6-BA濃度為1.0mg/L。此外，由于在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，有積累6-BA的現(xiàn)象，因此，隨著繼代培養(yǎng)的代數(shù)增加，應(yīng)適當(dāng)降低6-BA的濃度，以防6-BA濃度過(guò)高抑制叢生芽的分化。

許莉萍等[14]報(bào)道，同時(shí)附加6－BA和NAA的處理促根效果不如只含有NAA的處理。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似，即6-BA對(duì)甘蔗品種“粵糖55號(hào)”的生根誘導(dǎo)具有明顯的抑制作用。同時(shí)，在已報(bào)道的文獻(xiàn)中，對(duì)甘蔗組培苗誘導(dǎo)生根的NAA濃度各不相同，大多數(shù)采用高濃度的NAA（≥4.0mg/L）[10-11，14，16-17]，但也有采用相對(duì)較低濃度的NAA（≤2mg/L）[13，15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAA濃度太高太低對(duì)生根誘導(dǎo)均不利，2.0mg/L時(shí)，誘導(dǎo)的根數(shù)和根長(zhǎng)達(dá)最大值。

綜上所述，甘蔗品種“粵糖55號(hào)”腋芽的離體快速繁殖技術(shù)流程為：用帶腋芽的甘蔗莖段作外植體材料，經(jīng)0.1%HgCl2消毒7min后，接種到MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行啟動(dòng)培養(yǎng)，然后分別用MS+6-BA1.0 mg/L和MS+NAA2.0mg/L兩種培養(yǎng)基對(duì)甘蔗組培苗進(jìn)行繼代和生根培養(yǎng)，甘蔗組培苗生根煉苗后，移到木糠中假植30d，最后把假植的甘蔗組培苗移栽大田。

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