戚永奎, 陳 濤,朱 明, 陳建平, 沈羊城, 陳永紅, 葛兆建*

(1.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224002；2.鹽城師范學(xué)院，江蘇 鹽城 224002；3.農(nóng)業(yè)部 沿海鹽堿地農(nóng)業(yè)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，江蘇 鹽城 224002；4.鹽城市呈祥園藝有限公司，江蘇 鹽城 224014；5.鹽城昕宇農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇 鹽城 224024)

向日葵按習(xí)慣分為野生向日葵、栽培向日葵和觀賞向日葵[1]。近年來(lái)，隨著鄉(xiāng)村旅游的迅猛發(fā)展，觀賞向日葵越來(lái)越受到人們的青睞。而由于向日葵是異花授粉作物，在開(kāi)放授粉的情況下天然異交率較高，自交結(jié)實(shí)率較低[2]，不利于種子的繁育和推廣。外植體的離體培養(yǎng)作為一種高效的生物技術(shù)手段可以大量生產(chǎn)優(yōu)良無(wú)性系，在向日葵新品種繁育和改良中具有巨大的應(yīng)用潛力[3]，受到育種家們的重視。傳統(tǒng)向日葵的再生途徑主要通過(guò)器官[4-8]和胚胎發(fā)生而產(chǎn)生[9-11]，外植體的類(lèi)型主要有下胚軸、子葉、子葉節(jié)和莖尖等[4]，但向日葵從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或者組織分化再生植株困難[12]，轉(zhuǎn)化頻率不高，并且重復(fù)性差，是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化作物。關(guān)于利用腋芽作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，前人在蝴蝶蘭[13]、鉆天柳[14]等作物上均取得了較好的效果，但在向日葵上鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)主要嘗試以腋芽作為外植體，研究其在觀賞向日葵上的組培效果及配套技術(shù)，以期豐富向日葵組織培養(yǎng)外植體類(lèi)型，提高再生頻率，解決部分觀賞向日葵品種繁殖系數(shù)低的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試品種為YAN1339、YAN1328、YAN1569、YAN1527。其中YAN1339為黃色多頭普通觀賞向日葵，YAN1328為紫色多頭普通觀賞向日葵，YAN1569為白色多頭普通觀賞向日葵，YAN1527為黃色菊花型(重瓣)多頭觀賞向日葵。所有材料均為江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所觀賞葵花課題組的自育新品系。

1.2 外植體的選擇和處理

選取頂花即將開(kāi)放或者已經(jīng)開(kāi)放的向日葵植株，采回后首先將整個(gè)植株分成幾段，用洗潔凈清洗干凈，然后用清水沖洗0.5 h，將所有腋芽切下后，先用75%乙醇浸泡30～60 s，再用10%過(guò)氧化氫或者3%次氯酸鈉溶液消毒15～20 min，然后在超凈工作臺(tái)上，切取腋芽5 mm大小的頂部作為外植體，接種到培養(yǎng)基上。

1.3 培養(yǎng)條件

組織培養(yǎng)室溫度25～28 ℃，日光燈每天光照時(shí)間12 h，光照強(qiáng)度1600 lx，固體培養(yǎng)基含7.5 g/L瓊脂，滅菌前調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0。將向日葵外植體接種于50 mL三角瓶中。外植體在培養(yǎng)25～30 d后直接分化出不定芽，繼續(xù)培養(yǎng)10～15 d后繼代培養(yǎng)1次。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)處理接種外植體15～20個(gè)，愈傷率2周后統(tǒng)計(jì)，不定芽誘導(dǎo)率6周后統(tǒng)計(jì)。利用SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腋芽日齡對(duì)觀賞向日葵不定芽形成的影響

試驗(yàn)以黃色菊花型觀賞向日葵YAN1527為材料，以MS+0.03 mg/L NAA+0.9 mg/L 6-BA為培養(yǎng)基，在腋芽開(kāi)始分化時(shí)選取單株，標(biāo)記腋芽的日齡，分別選取觀賞向日葵頂花開(kāi)放1～3 d、4～6 d、7～10 d、11～13 d、14 d以上等5種不同日齡的腋芽進(jìn)行處理。結(jié)果表明：腋芽日齡越低，其組培效果越好，更容易分化出不定芽，1～3 d的腋芽不定芽誘導(dǎo)率最高達(dá)80.25%，而4～6 d、7～10 d、11～13 d的腋芽誘導(dǎo)率較之1～3 d的腋芽分別降低3.58、26.75、31.82個(gè)百分點(diǎn)，14 d以上的腋芽已經(jīng)基本失去培養(yǎng)價(jià)值，誘導(dǎo)率僅為27.25%(圖1)。由此可見(jiàn)，選取適齡的腋芽組培是觀賞向日葵組培成功的關(guān)鍵，觀賞向日葵最佳的外植體是1～6 d的腋芽，但是由于1～3 d的腋芽采集比較困難，實(shí)際操作時(shí)以選取4～6 d的腋芽為宜。

圖1 不同腋芽日齡對(duì)觀賞向日葵不定芽形成的影響

2.2 不同6-BA濃度對(duì)不同基因型觀賞向日葵腋芽誘導(dǎo)不定芽的影響

在加入等量0.03 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA，濃度處理包括0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/L共6個(gè)濃度梯度，以4種供試基因型4～6 d的腋芽作為外植體材料，研究不定芽的誘導(dǎo)效果。結(jié)果表明：不同基因型觀賞向日葵在不同濃度的6-BA培養(yǎng)基上培養(yǎng)不定芽的誘導(dǎo)率均呈拋物線分布，隨著6-BA濃度的增加不定芽的誘導(dǎo)率呈先增加后下降的趨勢(shì)。但是不同基因型誘導(dǎo)不定芽的最佳6-BA濃度略有不同，YAN1569白色多頭普通觀賞向日葵誘導(dǎo)不定芽的最佳6-BA濃度為0.6 mg/L，YAN1339黃色多頭普通觀賞向日葵和YAN1328紫色多頭普通觀賞向日葵的最佳6-BA濃度為0.6～0.9 mg/L，YAN1527黃色菊花型多頭觀賞向日葵誘導(dǎo)不定芽的最佳6-BA濃度為0.9～1.2 mg/L，普通花型多頭觀賞向日葵誘導(dǎo)不定芽需要的6-BA的濃度低于菊花型(重瓣型)觀賞向日葵的，白色普通觀賞向日葵不定芽的誘導(dǎo)率低于黃色和紫色向日葵的。不同基因型的最佳誘導(dǎo)率在76.5%～83.5%之間，均在80.0%左右，說(shuō)明不同基因型觀賞向日葵用腋芽誘導(dǎo)不定芽的潛力基本相同。

2.3 不同基因型觀賞向日葵外植體誘導(dǎo)對(duì)形成愈傷組織的影響

將4種不同基因型觀賞向日葵腋芽作為外植體，接種在含有上述不同濃度的所有培養(yǎng)基上，上述所有處理基本不形成愈傷組織或者愈傷組織很小，但是隨著時(shí)間的推移，外植體在明顯長(zhǎng)大。在20～25 d后，所有處理的部分外植體上開(kāi)始萌發(fā)不定芽，適中6-BA濃度處理的外植體上萌發(fā)得比較早且比例高，6-BA濃度太低和太高處理的不定芽萌發(fā)慢，同時(shí)在高濃度6-BA處理上萌發(fā)的不定芽長(zhǎng)勢(shì)較弱，甚至有停止生長(zhǎng)的現(xiàn)象(圖2)。而用向日葵花蕾作為外植體在組培15 d后開(kāi)始形成愈傷組織，一直維持60 d左右，此后愈傷組織開(kāi)始褐化而始終未能誘導(dǎo)出不定芽(圖2)。這種在向日葵組織培養(yǎng)上由外植體在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)膨大，不經(jīng)過(guò)愈傷階段直接萌發(fā)成不定芽的現(xiàn)象未曾見(jiàn)到類(lèi)似報(bào)道。

表1 不同6-BA濃度對(duì)不同基因型觀賞向日葵腋芽誘導(dǎo)不定芽的影響 %

注：同列數(shù)據(jù)后的小寫(xiě)字母表示在0.05水平上的差異顯著性，字母相同則差異不顯著，不同則顯著。下同。

A～D：腋芽誘導(dǎo)不定芽和不定根再生過(guò)程；E～F：花蕾形成愈傷組織及出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

3 討論

3.1 不同腋芽日齡對(duì)觀賞向日葵不定芽形成的影響

以腋芽作為外植體誘導(dǎo)不定芽在一些植物上有過(guò)報(bào)道，如張?jiān)獓?guó)等[13]以蝴蝶蘭花梗腋芽作為外植體，誘導(dǎo)率高達(dá)90%以上；王向軍等[14]利用鉆天柳腋芽進(jìn)行組培，繁殖系數(shù)達(dá)到10～30倍；胡峰等[15]以厚莢相思含有腋芽的莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)，不定芽的誘導(dǎo)率最高可以達(dá)到80.56%。前人研究表明，不同日齡的組培材料是影響外植體再生能力的重要因素[16-17]。本試驗(yàn)以黃色菊花型(重瓣型)觀賞向日葵YAN1527的不同日齡腋芽作為外植體，結(jié)果表明：低日齡腋芽誘導(dǎo)不定芽分化率高，其中1～3 d的腋芽不定芽誘導(dǎo)率最高可以達(dá)到80.25%，4～6 d的腋芽不定芽誘導(dǎo)率也達(dá)到76.67%，而7 d以上的腋芽分化率明顯降低，14 d以上的腋芽基本失去組培價(jià)值。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于1～3 d的腋芽獲取相對(duì)困難，可采取4～6 d的腋芽進(jìn)行觀賞向日葵組培。受胡峰等[15]研究的啟示，由于觀賞向日葵低日齡的腋芽作為外植體的不定芽誘導(dǎo)率高，是否可以嘗試使用含有腋芽的韌皮部作為外植體，從而提高不定芽的誘導(dǎo)率，有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同6-BA濃度和基因型對(duì)觀賞向日葵不定芽再生的影響

關(guān)于向日葵植株再生能力與基因型之間的關(guān)系，前人研究結(jié)果存在差異。劉寶等[18]認(rèn)為離體培養(yǎng)的再生能力與基因型間存在顯著的相關(guān)性，而Pugliesi等[5]認(rèn)為基因型和再生能力之間沒(méi)有關(guān)系，再生能力依賴于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之間數(shù)量上的互作。本試驗(yàn)以YAN1339、YAN1328、YAN1569、YAN1527等4種不同基因型的自交系為材料，以腋芽作為外植體，在加有相同量的0.03 mg/L NAA和不同濃度6-BA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同基因型最佳不定芽誘導(dǎo)率沒(méi)有顯著差異。這可能與本試驗(yàn)的4個(gè)材料都是由同一母本經(jīng)過(guò)開(kāi)放授粉后選育而成有關(guān)。但是，幾種基因型誘導(dǎo)不定芽再生的6-BA最佳濃度不同，普通花型的觀賞向日葵用腋芽作為外植體的6-BA最佳濃度為0.6～0.9 mg/L，而菊花型(重瓣型)觀賞向日葵用腋芽作為外植體的最佳6-BA濃度為0.9～1.2 mg/L。

3.3 不同外植體對(duì)形成愈傷組織的影響

劉海學(xué)等[4]以子葉、子葉節(jié)、下胚軸、真葉等作為外植體在MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)外植體平均愈傷率達(dá)到90%以上。本試驗(yàn)也曾用花蕾和下胚軸作為外植體，發(fā)現(xiàn)用花蕾和下胚軸作為外植體愈傷率達(dá)到100%，用花蕾作為外植體形成的愈傷組織呈黃綠色，愈傷塊較大，但是經(jīng)過(guò)60 d的培養(yǎng)，仍然不能誘導(dǎo)出不定芽，具體原因有待進(jìn)一步研究。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用腋芽作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，基本不形成愈傷組織，或者愈傷塊很小，但是在培養(yǎng)過(guò)程中，腋芽有明顯生長(zhǎng)增大的現(xiàn)象，且不定芽誘導(dǎo)率高。本研究表明，對(duì)于觀賞向日葵利用腋芽進(jìn)行組織培養(yǎng)，是否形成愈傷組織不是能否誘導(dǎo)不定芽的必要條件，而腋芽由于自身具有生長(zhǎng)點(diǎn)等特定的組織結(jié)構(gòu)，相對(duì)于其他外植體更容易誘導(dǎo)出不定芽，適合用作觀賞向日葵的外植體。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以觀賞向日葵作為研究載體，探討了以腋芽作為外植體不同日齡以及不同基因型和不同6-BA濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，低日齡的腋芽更容易誘導(dǎo)出不定芽，可以在不經(jīng)過(guò)愈傷組織的情況下直接產(chǎn)生不定芽，是否形成愈傷組織不是觀賞向日葵誘導(dǎo)出不定芽的必要條件。不同基因型間再生能力沒(méi)有顯著差異，但不同基因型不定芽最佳誘導(dǎo)率的6-BA濃度存在一定差異。在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)選擇低日齡腋芽作為外植體，根據(jù)不同基因型觀賞向日葵選擇適宜濃度的培養(yǎng)基，從而提高再生頻率。