陳曉玲，丁 菲，趙一入，江昌俊

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036）

體細(xì)胞胚發(fā)生作為20世紀(jì)后期植物組織培養(yǎng)中的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)和突破，與植物另一種再生方式即器官分化相比，具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點(diǎn)[1]，在很多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，如作為穩(wěn)定、高效的植物再生體系[2]和理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體體系[3]。植物體胚發(fā)生的方式分直接和間接兩種：不通過愈傷組織階段直接從外植體表面或內(nèi)部細(xì)胞產(chǎn)生體細(xì)胞胚的方式叫體胚的直接發(fā)生。先誘導(dǎo)出愈傷組織（直接誘導(dǎo)胚性愈傷，或由非胚性愈傷再轉(zhuǎn)化成胚性愈傷），體胚由胚性愈傷組織分化產(chǎn)生的方式叫做體胚的間接發(fā)生[4]。目前，在茶樹的組織培養(yǎng)中，對于體細(xì)胞胚發(fā)生的過程和不同階段的形態(tài)特征沒有詳細(xì)的報(bào)道。本文探究了茶樹體細(xì)胞胚的發(fā)生方式，描述了以茶樹子葉為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的各個(gè)階段的形態(tài)學(xué)特征，并進(jìn)行了相關(guān)細(xì)胞學(xué)分析，以期為茶樹離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

舒茶早 [C.sinensiscv.shuchazao]10月中旬的種子，采自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)園。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基P：MS+0.2 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3；蔗糖 30 g·L-1，瓊脂 0.75%，pH 5.8。白熾燈光照強(qiáng)度 50μmol·m-2·s-1，12h 光照，25±2℃培養(yǎng)。

1.3 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)

將采集的種子去除果皮，表面消毒，無菌操作下剝?nèi)シN皮，將子葉切割成0.5cm2，分為帶胚子葉和不帶胚子葉兩種處理，接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基P中，30d為一周期，繼代培養(yǎng)。觀察體細(xì)胞胚的形成過程。

1.4 體細(xì)胞胚的細(xì)胞學(xué)觀察

取供顯微觀察的體細(xì)胞胚材料，固定于FAA中，常規(guī)石蠟切片，切片厚10μm，番紅與固綠染色，顯微鏡下觀察、攝影。

2 結(jié)果與分析

2.1 體細(xì)胞胚產(chǎn)生的兩種方式

子葉在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的過程中，通過兩種方式產(chǎn)生體細(xì)胞胚。一種是直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚：帶胚子葉接種到培養(yǎng)基中，初代內(nèi)胚萌發(fā)出胚芽胚根，隨后在子葉柄處直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚，分化出芽叢（圖1-A）。直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚歷時(shí)很短，從接種2代內(nèi)即可發(fā)生并萌發(fā)。另一種是間接產(chǎn)生體細(xì)胞胚：子葉不帶胚部分在繼代培養(yǎng)中體積膨大，逐漸轉(zhuǎn)化成胚性愈傷組織，然后分化出體細(xì)胞胚（圖1-B）。通過間接方式產(chǎn)生體細(xì)胞胚時(shí)間較長，不同胚性愈傷組織的個(gè)體差異較大，繼代4～7代時(shí)，體細(xì)胞胚陸續(xù)發(fā)生。帶胚子葉可以通過直接和間接兩種方式產(chǎn)生體細(xì)胞胚，不帶胚子葉只通過間接方式產(chǎn)生體細(xì)胞胚。

圖1 體細(xì)胞胚產(chǎn)生的兩種方式

2.2 體細(xì)胞胚間接發(fā)生途徑各階段的形態(tài)特征

不帶胚子葉和帶胚子葉的子葉部分以間接方式產(chǎn)生體細(xì)胞胚。在誘導(dǎo)的過程中，不同階段形態(tài)特征差異較大。子葉離體培養(yǎng)3周左右，子葉表面產(chǎn)生大量的瘤狀突起（圖2-A），細(xì)胞團(tuán)不斷膨大形成胚性愈傷組織，顏色由淡黃色逐漸變?yōu)榫G色（圖2-B），繼代培養(yǎng)顏色繼續(xù)加深，至墨綠色時(shí)，其表面形成半透明顆粒狀小突起（圖2-C）即為體細(xì)胞胚，進(jìn)一步培養(yǎng)可萌發(fā)（圖2-D），分化出芽叢（圖2-E）。綠色加深是胚性愈傷組織成熟的表現(xiàn)。成熟的胚性愈傷組織在繼代中，一方面分化出體細(xì)胞胚并萌發(fā)出芽，另一方面產(chǎn)生次級胚性愈傷組織增殖（圖2-F）。新產(chǎn)生的次級胚性愈傷組織黃綠色、半透明（圖2-F），分割培養(yǎng)不會(huì)等到完全成熟時(shí)再產(chǎn)生下一級胚性愈傷組織，而是成熟與增殖同時(shí)進(jìn)行（圖2-G）。次級胚性愈傷組織顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色時(shí)即有體細(xì)胞胚的分化（圖2-H）。

圖2 體細(xì)胞胚發(fā)生各階段的形態(tài)

2.3 體細(xì)胞胚的細(xì)胞學(xué)觀察

從形態(tài)學(xué)上觀察，綠色的胚性愈傷組織表面產(chǎn)生半透明的顆粒狀小突起繼續(xù)培養(yǎng)具有分化出芽的能力，即為體細(xì)胞胚，于是對其做了進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)觀察。以圖2-C所示組織為材料，石蠟切片（圖3）顯示，顆粒狀突起處細(xì)胞小且排列緊密，細(xì)胞質(zhì)濃，有若干個(gè)分生區(qū)域，說明此處細(xì)胞已完成脫分化，具有很強(qiáng)的分化能力。

圖3 體細(xì)胞胚處若干分生區(qū)域

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)茶樹體胚發(fā)生既可以通過直接方式也可以通過間接方式。2006年Seran等報(bào)道茶的體細(xì)胞胚直接從成熟胚的胚軸上產(chǎn)生[5]，但本實(shí)驗(yàn)中只在子葉柄處發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞胚的分化，胚軸上并未發(fā)現(xiàn)。子葉柄處直接分化出體細(xì)胞胚，可能與茶樹子葉柄本身存在胚性細(xì)胞，其表皮層或亞表皮層存在較強(qiáng)的器官發(fā)生潛力有關(guān)[6]。體細(xì)胞胚的間接發(fā)生途徑中，根據(jù)漸變理論[1]，茶樹子葉發(fā)生隆起是細(xì)胞脫分化、分化的標(biāo)志。

體細(xì)胞胚的直接發(fā)生途徑歷時(shí)短，不經(jīng)過愈傷組織階段，理論上遺傳穩(wěn)定性更強(qiáng)；而間接發(fā)生途徑產(chǎn)生的體胚數(shù)量大，并且通過產(chǎn)生次級胚性愈傷組織繼續(xù)分化，增殖倍高。胚性愈傷組織特定時(shí)期的細(xì)胞學(xué)觀察表明，體細(xì)胞胚在胚性愈傷組織上產(chǎn)生，二者不能等同。在組織培養(yǎng)中，可以根據(jù)胚性愈傷組織的形態(tài)特征，了解其所在的發(fā)育時(shí)期，以便更好地控制離體再生體系或選擇合適時(shí)期作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。

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