黃強，張明強

1.廈門大學(xué)嘉庚學(xué)院，福建 漳州 363105

2.漳州師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，福建 漳州 363000

硝基芳香族化合物作為重要的化工原料，廣泛用于醫(yī)藥、染料、農(nóng)藥、塑料等行業(yè)，其在生產(chǎn)和使用過程中被釋放到環(huán)境中，會對生態(tài)系統(tǒng)造成危害［1］，目前對含該類化合物的廢水處理成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點之一。對硝基苯酚(p-nitrophenol，PNP)是一種重要的環(huán)境污染物，已被我國列入水中優(yōu)先控制污染物黑名單［2］，治理該類化合物對保證人類健康具有重要意義。對硝基苯酚類廢水的處理方法有氧化還原法［3-4］、吸附法［5-6］和生化法［7-10］。利用生化法處理PNP廢水具有效率高、成本低的優(yōu)勢。國外對其生物降解的研究已有較長的時間［11］，但是不同微生物的降解速度各不相同，分離不同的PNP降解菌株對研究PNP的生物降解機制具有重要的意義，其能為PNP污染的生物修復(fù)提供優(yōu)良的材料。

固定化細胞技術(shù)作為現(xiàn)代化生物工程技術(shù)，是利用物理或化學(xué)手段將游離細胞定位于限定的空間領(lǐng)域，并使其保持活性，反復(fù)利用。與游離細胞方法相比，固定化技術(shù)克服了細胞太小，與水溶液分離較難，易造成二次污染等弊端，具有菌體密度高、反應(yīng)迅速、菌體流失少、產(chǎn)物易分離、反應(yīng)過程易控制等優(yōu)點，是一種很有前途的污染物處理技術(shù)［12］。細胞被固定化后，細胞內(nèi)酶系保存完整，相當(dāng)于一個多酶生物反應(yīng)器，可使反應(yīng)更加充分徹底，所以固定化細胞技術(shù)被廣泛應(yīng)用［13-14］。

筆者采用海藻酸鈉作細胞固定化的載體，以漳州某污水處理廠活性污泥中分離的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)為固定化對象，研究了pH、溫度、PDP初始濃度等對固定化細胞生物降解PNP效果的影響，并比較了游離細胞與固定化細胞在生物降解PNP過程中的活性。

1 材料與方法

1.1 試劑

試驗所用PNP為化學(xué)純試劑，其他各種藥劑均為分析純試劑。

無機鹽培養(yǎng)液:(NH4)2SO4，1.0 g/L;K2HPO4，0.7 g/L;KH2PO4，0.3 g/L;MgSO4，0.2 g/L;NaCl，0.5 g/L;加入適量的PNP作為唯一碳源。

無碳無氮培養(yǎng)液:K2HPO4，0.7 g/L;KH2PO4，0.3 g/L;MgSO4，0.2 g/L;NaCl，0.5 g/L;加入適量的PNP作為唯一碳源和氮源。

富集培養(yǎng)基:蛋白胨，5 g/L;牛肉膏，3 g/L;NaCl，5 g/L。pH 為 7.4，121 ℃高壓滅菌 20 min，該培養(yǎng)基用于菌株的擴大培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2102PC紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器廠);SHA-B恒溫振蕩器(常州國華科技儀器有限公司);TGL-16G臺式離心機(上海浦東物理光學(xué)儀器廠);Sartorius電子天平(德國賽多利斯集團);AIR TECH超凈工作臺(北京格瑞恩科技發(fā)展有限公司);LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海中安醫(yī)療器械廠);PYX-250s-B生化培養(yǎng)箱(海口博艾森科技開發(fā)有限公司);Sartorius PB-10酸度計(德國賽多利斯集團);ML-902定時恒溫磁力攪拌器(上海五相儀器儀表有限公司)。

1.3 菌種

P.aeruginosa從漳州某污水處理廠的活性污泥中分離獲得，并鑒定保存。

1.4 分析項目

PNP濃度:取生物降解后的PNP培養(yǎng)液4 mL，12000 r/min離心10 min，取上清稀釋一定倍數(shù)，用1 mol/L的HCl調(diào)pH為4.0，用紫外分光光度計掃描(200～400 nm)，觀察特征峰(317 nm)的消失，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算PNP濃度及降解率(η):

式中，C0和C分別為降解前后PNP濃度，mg/L。

吸光度(A):采用紫外分光光度計在波長為600 nm下進行檢測，以初始培養(yǎng)液(未接菌懸液時)為空白參比。

亞硝酸根采用對氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺比色法［15］測定。

以上各試驗均做3組平行試驗，數(shù)值為3組平行試驗結(jié)果的平均值。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌懸液的制備

將P.aeruginosa菌株活化并擴大培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期［16］的濕菌體，8‰生理鹽水洗滌后，以8000 r/min速度離心10 min，收集菌泥，將其制備成濃度為80%的菌懸液。

1.5.2 固定化細胞的制備

以海藻酸鈉為載體，采用包埋法［17］制備固定化細胞，并通過正交試驗優(yōu)化固定化細胞的制備條件。按1 g菌懸液加入10 mL海藻酸鈉膠液的比例充分混合均勻制成菌膠混合液，用直徑為1.5 mm針頭將菌膠混合液滴入4℃連續(xù)攪拌的30 mL CaCl2溶液中，形成凝膠顆粒，在4℃交聯(lián)鈣化一定時間后，得到直徑為3～4 mm的固定化小球，該小球用8‰生理鹽水洗滌2次，即可以使用。

1.5.3 固定化細胞的PNP生物降解試驗

研究了pH、溫度、PNP初始濃度對PNP生物降解效果的影響，并通過菌株生長曲線、降解時間動力學(xué)曲線及降解產(chǎn)物的測定，分析P.aeruginosa菌株的固定化細胞降解PNP的能力及活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種生長周期測定

菌種的生長周期對菌株的固定化非常重要。圖1為P.aeruginosa菌株的生長曲線。由圖1可知，菌株在培養(yǎng)9 h后開始進入對數(shù)生長期，約22 h進入生長平衡期。因此，對該菌種進行固定化時，應(yīng)選擇其對數(shù)生長期(9～22 h)的種液，以保持其最高活性。

圖1 P.aeruginosa菌株生長曲線Fig.1 The growth curve of bacterium Pseudomonas aeruginosa

2.2 正交法優(yōu)化細胞固定化的最佳條件

影響固定化細胞降解效果的因素主要有包埋的菌體量、海藻酸鈉膠液濃度、CaCl2濃度以及交聯(lián)鈣化時間。采用正交試驗法，進行四因素三水平L9(34)正交試驗［18］(表 1)，以 PNP 的降解率為指標(biāo)進行最佳制備條件的確定。

表1 固定化細胞正交試驗設(shè)計Table 1 Factors and levels of the cross-test experiments

按表1的因素和水平，采用1.5節(jié)方法制得9組固定化細胞(各組海藻酸鈉膠液均為10 mL)，分別加入初始濃度為50 mg/L的PNP培養(yǎng)液25 mL，調(diào)節(jié)pH為8.0，培養(yǎng)溫度30℃，120 r/min旋轉(zhuǎn)搖床振蕩42 h，測定PNP的降解率，結(jié)果如表2和表3所示。

表2 試驗數(shù)據(jù)分析Table 2 Analysis of the experimental data

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

從表2和表3可以看出，各因素水平的最優(yōu)組合為A3B2C1D3。即每mL海藻酸鈉包埋的菌體量為0.3 g，海藻酸鈉膠液濃度為3%，CaCl2濃度為4%，交聯(lián)鈣化時間為12 h。

2.3 pH的影響

將P.aeruginosa菌株的固定化細胞和與之菌量相等的濕菌體(游離細胞)分別接種于25 mL初始濃度為100 mg/L的PNP無機鹽培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)pH 分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0，培養(yǎng)溫度30℃，120 r/min旋轉(zhuǎn)搖床振蕩40 h，測定 PNP濃度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH對PNP生物降解性能的影響Fig.2 Effect of pH on the performance of degrading PNP

考察pH對固定化細胞降解PNP效果影響的同時，還應(yīng)考慮pH對固定化載體牢固程度的影響。當(dāng)培養(yǎng)液pH調(diào)至10.0以上時，固定化載體的牢固程度下降，載體部分溶解。由圖2可知，與游離細胞相似，固定化細胞降解PNP的最適pH為8.0～9.0。在各pH范圍內(nèi)，固定化細胞對PNP的降解能力均好于游離細胞。

2.4 溫度的影響

將P.aeruginosa菌株的固定化細胞和與之菌量相等的濕菌體(游離細胞)分別接種于25 mL初始濃度為50 mg/L的PNP無機鹽培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)pH為8.0，培養(yǎng)溫度分別為 20、25、30、35、40 ℃，120 r/min旋轉(zhuǎn)搖床振蕩40 h，測定PNP濃度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對PNP生物降解性能的影響Fig.3 Effect of temperature on the performance of degrading PNP

考察溫度對PNP生物降解活性的影響，對探討該方法在不同環(huán)境溫度的應(yīng)用具有重要意義。由圖3可知，在不同的溫度下，固定化細胞對PNP的生物降解能力均好于游離細胞。與游離細胞相似，固定化細胞降解PNP的最適溫度為30～35℃。

2.5 PNP初始濃度的影響

將P.aeruginosa菌株的固定化細胞和與之菌量相等的濕菌體分別接種于PNP初始濃度為25、50、100、150、200、250、300 和 350 mg/L 的 25 mL 無機鹽培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)pH為8.0，培養(yǎng)溫度為30℃，120 r/min旋轉(zhuǎn)搖床振蕩40 h，測定PNP濃度，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)PNP初始濃度為350 mg/L時，游離細胞的降解率接近于0，而固定化細胞的降解率為4.35%。與游離細胞相比，固定化細胞降解PNP耐受濃度有一定幅度的提高，這是由于在固定化系統(tǒng)中，PNP需擴散進入載體內(nèi)部，才能被包埋在載體內(nèi)的微生物細胞分解［19］。擴散作用使PNP濃度從載體外部到內(nèi)部由高到低，形成濃度梯度［15］，減輕了PNP對載體內(nèi)菌株的毒性，利于菌株對PNP的降解，并可加強其對PNP毒性的耐受力。

圖4 PNP初始濃度對生物降解性能的影響Fig.4 Effect of different initial PNP concentration on PNP degradation

2.6 固定化細胞降解PNP的動力學(xué)曲線

將P.aeruginosa菌株的固定化細胞接種于初始濃度為50 mg/L的PNP無機鹽培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)pH為8.0，培養(yǎng)溫度為30℃，120 r/min旋轉(zhuǎn)搖床振蕩培養(yǎng)，進行固定化細胞降解PNP的時間動力學(xué)觀察，結(jié)果如圖5所示。

圖5 固定化細胞降解PNP的時間動力學(xué)曲線Fig.5 Kinetic curve of degradation of PNP by immobilized cells

由圖5可知，游離細胞與固定化細胞在PNP降解初期均有一段延滯期，游離細胞的延滯期約為38 h，固定化細胞的延滯期約為35 h。這是因為PNP對菌株的生長有抑制作用，即使是馴化后的菌株放入反應(yīng)體系，也有一段適應(yīng)期，所以在開始的一段時間PNP的降解速率很慢。而載體對于提高菌株的抗沖擊能力具有一定的作用，所以固定化細胞的延滯期縮短。

固定化細胞的降解曲線分為0～35和35～42 h兩段。隨著菌株生長的開始(35～42 h)，PNP迅速被生物降解，約7 h生物降解完全結(jié)束。

將上述固定化細胞再次利用，在同樣條件下生物降解PNP，其時間動力學(xué)曲線如圖6所示。由圖6可知，再次利用的固定化細胞，延滯期縮短為2 h，且生物降解速度明顯升高，約6 h生物降解完全結(jié)束。

圖6 再次利用固定化細胞降解PNP的時間動力學(xué)曲線Fig.6 Kinetic curve of degradation of PNP by reused immobilized cells

試驗表明，固定化細胞連續(xù)使用3次效果穩(wěn)定。當(dāng)固定化細胞第4次利用時，載體的機械強度變差，固定化小球破裂。這可能是由于固定的菌株產(chǎn)生能分解海藻酸鈉的酶，有待進一步探討。

2.7 生物降解產(chǎn)物鑒定

采用對氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺比色法鑒定PNP生物降解后的產(chǎn)物，結(jié)果表明，經(jīng)生物降解后的溶液中存在中間代謝產(chǎn)物NO2-。當(dāng)在無氮無碳培養(yǎng)基中加入PNP進行培養(yǎng)時，P.aeruginosa菌株的固定化細胞可利用釋放的NO2-作為氮源進行生長。

3 結(jié)論

(1)采用正交法制備P.aeruginosa菌株固定化細胞，其最佳操作條件:每mL海藻酸鈉包埋菌懸液量為0.3 g;海藻酸鈉膠液濃度為3%;CaCl2濃度為4%;交聯(lián)鈣化時間為12 h。

(2)P.aeruginosa菌株固定化細胞對PNP的降解速度大于游離細胞，固定化細胞對PNP的耐受濃度比游離細胞高，這可能是由于在固定化系統(tǒng)中，擴散作用使PNP濃度從載體外部到內(nèi)部由高到低，形成濃度梯度，減輕了PNP對載體內(nèi)菌株的毒性，有利于菌株對PNP的生物降解，并可以加強其對PNP的耐受能力。

(3)P.aeruginosa菌株的固定化細胞隨著外界pH的增加，對PNP的降解率逐漸增大，但當(dāng)pH大于10.0，固定化載體會出現(xiàn)部分溶解，因此其生物降解的最適pH為8.0～9.0。此外，與游離細胞相似，固定化細胞降解PNP的最適溫度為30～35℃。

(4)游離細胞與固定化細胞在生物降解初期均有一段延滯期，游離細胞的延滯期約為38 h，固定化細胞的延滯期約為35 h。這是因為載體對于提高菌株的抗沖擊能力具有一定的作用，所以固定化細胞的延滯期縮短。

(5)采用對氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺比色法鑒定PNP生物降解后的產(chǎn)物，結(jié)果表明，經(jīng)生物降解后的溶液中存在中間代謝產(chǎn)物NO2-，這說明在無添加氮的情況下，P.aeruginosa菌株的固定化細胞可利用釋放的NO2-作為氮源進行生長。

［1］沈標(biāo)，李順鵬，趙碩偉，等.氯酚、對硝基酚對土壤生物活性的影響［J］.土壤學(xué)報，1997，34(3):309-314.

［2］周文敏，傅得黔，孫宗光.水中優(yōu)先控制污染物黑名單［J］.中國環(huán)境監(jiān)測，1990，6(4):1-3.

［3］LI S X，ZHENG F Y，LIU X L，et al.Photocatalytic degradation of p-nitrophenolon nanometersize titanium dioxide surface modified with 5-sulfosalicylic acid［J］.Chemosphere，2005，61:589-594.

［4］梁宇寧，黃智，覃思晗，等.Cu2O光催化降解水中對硝基苯酚的研究［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2003，4(10):36-39.

［5］郭坌梅，馬毅杰，韓和平.有機膨潤土吸附對硝基苯酚的性能及其主要影響因素的探討［J］.山西大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2001，24(1):89-92.

［6］郝存江，馮青琴，元炯亮.改性蜂窩煤渣吸附水中對硝基苯酚研究［J］.化學(xué)世界，2004(4):320-323.

［7］高士祥，王燦，孔德洋，等.β環(huán)糊精對對硝基苯酚微生物降解的影響［J］.環(huán)境化學(xué)，2003，22(5):445-449.

［8］崔中利，張瑞福，何健，等.對硝基苯酚降解菌P3的分離、降解特性及基因工程菌的構(gòu)建［J］.微生物學(xué)報，2002，42(1):19-26.

［9］劉智，張曉舟，何健，等.營養(yǎng)物質(zhì)及金屬離子對DLL-E4菌降解對硝基苯酚的影響［J］.土壤學(xué)報，2004，41(2):292-297.

［10］王燦，高士祥，楊光俊，等.環(huán)糊精對硝基化合物混合體系微生物降解影響［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2004，24(4):429-432.

［11］SPONZA D T，KUSCU O S.p-Nitrophenol removal in a sequential anaerobic migrating blank reactor(AMBR)/aerobic completely stirred tank reactor(CSTR)system［J］.Process Biochemistry，2005，40:1679-1691.

［12］黃霞，俞毓馨，王蕾.固定化細胞技術(shù)在廢水處理中的應(yīng)用［J］.環(huán)境科學(xué)，1983，4(1):41.

［13］沈耀梁，黃勇，趙丹，等.固定化微生物污水處理技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002:166.

［14］馬子駿，陸志號.固定化細胞技術(shù)及其應(yīng)用［M］.銀川:寧夏人民出版社，1989:100-101.

［15］李彥秋.固定化微生物處理低濃度含氮廢水的研究［D］.南京:南京理工大學(xué)，2009.

［16］馬艷玲.固定化假單胞菌降解油煙廢氣的研究［J］.環(huán)境工程學(xué)報，2009，3(10):1856-1860.

［17］王秀，張小平.固定化藻菌小球流化床光生物反應(yīng)處理高濃度有機廢水研究［J］.凈水技術(shù)，2009，28(1):54-57.

［18］李春喜，王志和，王文林.生物統(tǒng)計學(xué)［M］.2版.北京:科學(xué)出版社，2000:277.

［19］MENKE B， REHM H-J.Degradation of mixtures of monochlorophenols and phenolas substrate for free and immobilized cells of Acaligenes sp.A7-2［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1992，37:655-661. ○