邊 慧, 方 松,2, 繆應(yīng)達(dá), 余化霖,*

（1. 昆明醫(yī)學(xué)院, 云南 昆明 650032; 2. 南昌大學(xué) 第一附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)科, 江西 南昌 330006; 3. 中國(guó)人民銀行 昆明市中心支行, 云南 昆明 650223）

兩種不同訓(xùn)練時(shí)程方法對(duì)海馬損傷大鼠水迷宮成績(jī)的影響

邊 慧1, 方 松1,2, 繆應(yīng)達(dá)3, 余化霖1,*

（1.昆明醫(yī)學(xué)院,云南 昆明650032; 2.南昌大學(xué) 第一附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)科,江西 南昌330006; 3.中國(guó)人民銀行 昆明市中心支行,云南 昆明650223）

為探討訓(xùn)練時(shí)程對(duì)大鼠水迷宮成績(jī)的影響, 采用直流電解法建立雙側(cè)背側(cè)海馬損傷大鼠模型, 并通過(guò)5 d (5 d training)和7 d訓(xùn)練 (7 d training)兩種不同時(shí)程法檢測(cè)海馬損傷大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果表明, 兩種訓(xùn)練法均反映大鼠空間學(xué)習(xí)能力減退, 而在檢測(cè)空間記憶障礙時(shí)則略有不同。與5 d訓(xùn)練法相比, 7 d訓(xùn)練法不僅顯示大鼠穿臺(tái)次數(shù)下降, 且其在目標(biāo)象限中的停留時(shí)間百分比亦下降。

水迷宮; 空間學(xué)習(xí)記憶; 海馬損傷

Morris水迷宮(Morris water maze, MWM)實(shí)驗(yàn)由英國(guó)心理學(xué)家Morris于1981 年建立, 并隨后進(jìn)行了不斷的完善及改進(jìn), 最初用于研究大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能(Morris, 1981, 1984)。目前MWM已成為研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶能力最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一, 廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域(D’Hooge & De Deyn, 2001)。

MWM實(shí)驗(yàn)是依賴于海馬的空間學(xué)習(xí)記憶任務(wù),而該任務(wù)的完成以海馬結(jié)構(gòu)、功能的完整性為前提(D’Hooge & De Deyn, 2001)。當(dāng)不同原因?qū)е潞ｑR結(jié)構(gòu)或功能不完整時(shí)會(huì)損害動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力, 進(jìn)而影響該動(dòng)物的MWM成績(jī)(Morris et al, 1982; Morris, 1984)。

自MWM建立以來(lái), 已有諸多研究者根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)經(jīng)典MWM進(jìn)行調(diào)整, 建立了多種MWM實(shí)驗(yàn)方案(Vorhees & Williams, 2006)。不同研究者在水迷宮具體操作方面大致相同, 但又稍有區(qū)別。例如, 隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)由多個(gè)訓(xùn)練日構(gòu)成, 其目的是使動(dòng)物在連續(xù)多日的訓(xùn)練中學(xué)會(huì)登上隱藏平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)規(guī)則，并理解如何得到救援(Hodges, 1996)。但在此過(guò)程中每天具體的訓(xùn)練次數(shù)以及總的訓(xùn)練時(shí)程并沒(méi)有統(tǒng)一要求, 每天的訓(xùn)練次數(shù)從2～10次不等, 訓(xùn)練時(shí)程多為6～15個(gè)訓(xùn)練日。那么, 不同的訓(xùn)練時(shí)程能否對(duì)MWM成績(jī)產(chǎn)生不同的影響，尤其是該影響是否依賴于海馬的完整性, 目前尚無(wú)明確答案。為此, 本研究擬采用MWM來(lái)檢測(cè)直流電解法建立的雙側(cè)背側(cè)海馬損傷大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力, 觀察5 d、7 d兩種不同訓(xùn)練時(shí)程的方法是否影響其MWM成績(jī), 從而尋找一種更適合本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠?xùn)練方法, 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠購(gòu)于昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 購(gòu)買時(shí)體重180～200 g, 許可證編號(hào)為SCXK(滇)2005-0008。實(shí)驗(yàn)開始前, 所有實(shí)驗(yàn)用鼠在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)至少一周。大鼠飼養(yǎng)在動(dòng)物籠內(nèi), 自由進(jìn)水取食, 12 h明、暗交替(光照時(shí)間：07：00—19：00), 室溫(23±2) ℃。操作符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組

大鼠設(shè)置為5 d訓(xùn)練組：對(duì)照 (control)8只、海馬損傷 (lesion) 11只; 7d訓(xùn)練組：對(duì)照(control)12只、海馬損傷 (lesion)11只。

動(dòng)物模型建立：大鼠腹腔注射硫酸阿托品(0.3 mL/只, 天津金耀氨基酸有限公司)及戊巴比妥鈉(45 mg/kg體重, Sigma)致麻醉后, 將其固定在腦立體定位儀上(深圳瑞沃德生命科技有限公司)。依次切開頭皮、肌肉以暴露顱骨, 在海馬上方顱骨鉆孔4個(gè), 孔徑約為1 mm。將僅尖端暴露1 mm的涂有絕緣漆的不銹鋼針灸針(直徑為0.3 mm, 蘇州醫(yī)療用品廠)垂直插入大鼠背側(cè)海馬。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜 (Paxinos & Watson, 1998)確定大鼠背側(cè)海馬坐標(biāo)：前囟后4 mm, 中線左/右旁2 mm 及3.4 mm,顱骨下4 mm。打開直流電損毀儀進(jìn)行直流電解,參數(shù)為2 mA, 60 s。手術(shù)結(jié)束后縫合頭皮, 局部涂擦紅霉素軟膏, 同時(shí)連續(xù)3 d肌肉注射青霉素鈉4× 106U預(yù)防感染。手術(shù)后4周進(jìn)行水迷宮檢測(cè)。

1.3 水迷宮檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)所用水迷宮為一直徑180 cm、高50 cm的圓形水池, 池內(nèi)水深31 cm (適應(yīng)階段為29 cm),水溫維持在(21±1) ℃。黑色遮光簾將水池圍起以減少其他因素的干擾, 遮光布簾上貼有不同形狀顏色圖形作為標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)間內(nèi)光線恒定, 水面漂浮覆蓋褐色塑料顆粒, 使大鼠看不見平臺(tái)和池底。水迷宮被等分為第Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ象限, 參照 Vorhees & Williams (2006)的方法取西北、北、東、東南等4個(gè)入水點(diǎn), 平臺(tái)置放于第Ⅱ象限(目標(biāo)象限)正中。水迷宮實(shí)驗(yàn)由熟悉適應(yīng)、隱藏平臺(tái)及空間探索三部分組成。第一天為熟悉適應(yīng)過(guò)程, 逃逸平臺(tái)暴露且高出水面1 cm, 將大鼠面壁放入水迷宮自由游泳120 s適應(yīng)環(huán)境, 記錄大鼠尋求并登上平臺(tái)所需的時(shí)間,即逃避潛伏期(latency); 若120 s后大鼠未找到平臺(tái),則將其引導(dǎo)至平臺(tái)并停留60 s; 共進(jìn)行4次訓(xùn)練。隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)歷時(shí) 5 d (或7 d), 逃逸平臺(tái)隱藏于水下1 cm。每天每只大鼠接受4 次訓(xùn)練, 記錄方式同適應(yīng)階段, 具體訓(xùn)練流程參照 Vorhees & Williams (2006)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在最后一次隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h開始,撤除平臺(tái), 將大鼠從第Ⅲ象限(目標(biāo)象限的對(duì)面象限)中點(diǎn)放入水中,記錄 120 s內(nèi)大鼠在4個(gè)象限的游泳時(shí)間百分比及穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。迷宮上方安裝連接顯示系統(tǒng)的攝像頭,大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡的記錄和分析采用中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所研制開發(fā)的軟件完成。

水迷宮檢測(cè)前1周進(jìn)行大鼠的運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)檢測(cè)(balance beam和 prehensile-traction)以評(píng)價(jià)其運(yùn)動(dòng)功能。結(jié)果顯示, 損傷組與對(duì)照組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 提示損傷組大鼠無(wú)運(yùn)動(dòng)障礙。

1.4 組織學(xué)檢查

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)電極損傷區(qū)域進(jìn)行組織學(xué)檢查,分別用生理鹽水及4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌流后取腦。多聚甲醛固定, 20%、30%蔗糖溶液梯度脫水后,做冰凍冠狀切片, 片厚20 μm, 然后進(jìn)行HE染色觀察海馬損傷情況。若定位不在背側(cè)海馬的動(dòng)物棄之不用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以mean±SE表示, 水迷宮的逃避潛伏期采用重復(fù)測(cè)量方差分析; 空間探索實(shí)驗(yàn)中的各象限游泳時(shí)間百分比采用單因素方差分析, 組間比較及空間探索實(shí)驗(yàn)中的穿臺(tái)次數(shù)采用非配對(duì)t-檢驗(yàn)分析。所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算由SPSS13.0軟件完成,P≤0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)檢查

切片經(jīng)HE染色顯示, 模型組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)不完整, 椎體細(xì)胞層破壞, 大量細(xì)胞缺失, 排列紊亂疏松, 損傷區(qū)域主要位于背側(cè)海馬及其周圍(圖1)。

圖1 直流電解損傷大鼠雙側(cè)背海馬(HE染色法)Fig.1 Bilateral dorsal electrolytic injured hippocampus (Hematoxylin-Eosin staining)

2.2 水迷宮空間學(xué)習(xí)能力比較

將大鼠每天4次的逃避潛伏期取平均值得到每天的水迷宮平均逃避潛伏期。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示, 5 d訓(xùn)練組對(duì)照、海馬損傷大鼠的平均逃避潛伏期總體比較具顯著性差異[F(1,17)=4.98,P＜0.05]。與對(duì)照組相比, 海馬損傷大鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)[非配對(duì)t-檢驗(yàn)：t=-2.74,P＜0.05 (d4);t=-2.40，P＜0.05 (d5); t=-4.30，P＜0.01 (d6)](圖2)。7 d訓(xùn)練組對(duì)照、海馬損傷大鼠的平均逃避潛伏期總體比較有顯著性差異[F(1,21)=26.10,P＜0.01]。與對(duì)照相比,海馬損傷大鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)[非配對(duì)t-檢驗(yàn)：t=-3.88，P＜0.01(d2);t=-4.47，P＜0.01(d3);t=-3.79，P＜0.01(d4);t=-4.43，P＜0.01(d5);t=-4.69，P＜0.01(d6);t=-3.59，P＜0.01(d7);t=-3.18，P＜0.01(d8) ] (圖3)。

圖2 5 d訓(xùn)練組平均逃避潛伏期Fig.2 Average latency of the 5 d training group

2.3 水迷宮空間記憶能力比較

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5 d訓(xùn)練組、7 d訓(xùn)練組海馬損傷大鼠穿臺(tái)次數(shù)明顯減少, 與對(duì)照組相比,有顯著性差異[非配對(duì)t-檢驗(yàn)：STt=3.10，P＜0.01; LTt=-5.92，P＜0.01] (圖4)。5 d訓(xùn)練組海馬損傷大鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比高于對(duì)面象限[LSD: target quadrantvsopposite quadrantP＜0.05]; 7 d訓(xùn)練組海馬損傷大鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比下降,與對(duì)面象限游泳時(shí)間百分相比, 無(wú)顯著性差異[LSD: target quadrantvsopposite quadrantP＞0.05] (圖5)。

圖3 7 d訓(xùn)練組平均逃避潛伏期Fig.3 Average latency of the 7 d training group

圖4 5 d訓(xùn)練組、7 d訓(xùn)練組穿臺(tái)次數(shù)Fig. 4 Times of crossing the platform location of the 5 d and7 d training group

圖5 5 d、7 d訓(xùn)練組在目標(biāo)象限及對(duì)面象限的游泳時(shí)間百分比Fig.5 The swimming time percentages of 5 d and 7 d training groups in the target quadrant vs opposite quadrant

3 討 論

本研究采用兩種不同時(shí)程的訓(xùn)練方法來(lái)探討訓(xùn)練時(shí)程是否會(huì)對(duì)雙側(cè)背側(cè)海馬損傷大鼠的水迷宮成績(jī)產(chǎn)生影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中,兩種訓(xùn)練法的海馬損傷大鼠均表現(xiàn)為逃避潛伏期明顯延長(zhǎng), 提示大鼠的空間學(xué)習(xí)能力下降。該結(jié)果與前人報(bào)道一致(Wood et al, 1993;Rapp & Gallagher, 1996)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中, 5 d訓(xùn)練組海馬損傷大鼠不能對(duì)平臺(tái)進(jìn)行精確定位, 穿臺(tái)次數(shù)明顯下降, 但對(duì)目標(biāo)象限仍有一定偏好; 當(dāng)把訓(xùn)練時(shí)程延長(zhǎng)2 d后,模型大鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中不表現(xiàn)明顯象限偏好,提示大鼠空間記憶能力下降, 即較長(zhǎng)時(shí)程的訓(xùn)練可以更徹底地反映大鼠背側(cè)海馬損傷的影響。

逃避潛伏期是隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的評(píng)價(jià)指標(biāo)。以往的研究發(fā)現(xiàn), 不同實(shí)驗(yàn)室之間MWM的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、訓(xùn)練方法、動(dòng)物種類及周圍環(huán)境等或多或少存在差異, 但逃避潛伏期受這些因素的影響較小, 檢測(cè)結(jié)果差別不大(Crabbe et al, 1999),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。當(dāng)改變訓(xùn)練時(shí)程時(shí),海馬損傷大鼠均表現(xiàn)明顯的空間學(xué)習(xí)障礙, 說(shuō)明兩種訓(xùn)練方法均能檢測(cè)出動(dòng)物空間學(xué)習(xí)能力的下降?？臻g探索實(shí)驗(yàn)是在一系列重復(fù)的隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的, Morris以成年正常雄性Lister大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 最初采取的是第一、二天各8次, 第三天4次, 共訓(xùn)練20次后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)的做法,結(jié)果顯示空間探索實(shí)驗(yàn)中大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯高于其他象限(Morris, 1981); 在隨后的實(shí)驗(yàn)中, 采用每天4次, 共訓(xùn)練28次后進(jìn)行空間記憶功能檢測(cè)的方法, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬背側(cè)和腹側(cè)均損傷的大鼠無(wú)明顯的象限偏好, 而海馬上方皮層損傷及空白對(duì)照組大鼠，則均表現(xiàn)出明顯的象限偏好, 且在目標(biāo)象限停留的時(shí)間高于其他象限(Morris et al, 1982)。 Moser et al (1995)使用鵝膏蕈氨酸損傷大鼠雙側(cè)背海馬, 然后每天8次, 共訓(xùn)練32次后檢測(cè)大鼠的空間記憶功能, 發(fā)現(xiàn)海馬損傷大鼠無(wú)明顯象限偏好。然而, 由于每天訓(xùn)練8次工作量很大, 故現(xiàn)在多采用每天訓(xùn)練4次的方法, 但不同研究者仍有其各異的訓(xùn)練法(Moser et al, 1993; Riedel et al, 1999)。我們?cè)谇捌谶M(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn), 5 d訓(xùn)練組海馬損傷大鼠不能對(duì)平臺(tái)進(jìn)行精確定位, 穿臺(tái)次數(shù)明顯下降, 但對(duì)目標(biāo)象限仍有一定的偏好?？紤]到海馬損傷大鼠只有經(jīng)過(guò)“足夠”的訓(xùn)練才可以達(dá)到提取記憶的目的, 我們將訓(xùn)練時(shí)程延長(zhǎng)后發(fā)現(xiàn)大鼠穿臺(tái)次數(shù)明顯下降且無(wú)明顯象限偏好, 提示大鼠的空間記憶能力明顯下降。兩種時(shí)程的方法產(chǎn)生差異的原因可能是由于海馬損傷大鼠的海馬結(jié)構(gòu)功能異常。對(duì)照組大鼠，經(jīng)過(guò)短期的訓(xùn)練足以達(dá)到穩(wěn)定的空間學(xué)習(xí)記憶狀態(tài), 而海馬損傷大鼠則需要延長(zhǎng)訓(xùn)練時(shí)程才可以達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種不同時(shí)程的訓(xùn)練方法均能反映海馬損傷大鼠的空間學(xué)習(xí)能力, 但在檢測(cè)空間記憶方面略有不同。當(dāng)用于檢測(cè)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)能力時(shí)傾向于選擇5 d訓(xùn)練法, 而檢測(cè)空間記憶能力時(shí)則可選擇7 d訓(xùn)練法。水迷宮實(shí)驗(yàn)作為測(cè)試動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法, 值得進(jìn)一步研究、完善。

致謝：感謝中科院昆明動(dòng)物所馬原野研究員、胡新天研究員給予的幫助, 感謝王正波博士在實(shí)驗(yàn)操作方面給予的幫助, 感謝于程洋同學(xué)在水迷宮實(shí)驗(yàn)中給予的幫助。

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Influences of two different training paradigms on spatial learning and memory performance of hippocampal injured rats

BIAN Hui1, FANG Song1,2, MIAO Ying-Da3, YU Hua-Lin1,*

(1. Kunming Medical College, Kunming 650032, China ; 2. Medical Department, First Affiliated Hospital of Jiangxi Medical University, Nanchang 330006, China ; 3. Kunming Branch, People’s Bank of China, Kunming 650223, China)

In this study, the 5 d and 7 d training paradigms were adopted to investigate the influences of different training procedures on the performance of spatial learning and memory of the hippocampal injured rats. The results showed that during the hidden-platform acquisition training, similar spatial learning dysfunctions were indicated in those two training paradigms. Whereas, when the spatial memories have been evaluated, compared with the 5 d training groups, the rats under 7 d training procedure not only crossed the platform location less, but also preferred to spend less time in the target quadrant.

Morris water maze; Spatial learning and memory; Hippocampal injury

R338; Q42

A

0254-5853-(2012)02-0237-04

10.3724/SP.J.1141.2012.02237

2011-08-09；接受日期：2011-11-20

“973”計(jì)劃(2007CB947703)

?通信作者(Corresponding author), E-mail: yuhl308@126.com

邊慧,昆明醫(yī)學(xué)院08級(jí)博士, E-mail: bh_032001@yahoo.com.cn