曾 珍, 劉至治, 潘連德, 唐文喬, 王 茜, 耿云皓

（上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306）

松江鱸魚野生群體遺傳多樣性的RAPD分析和SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化

曾 珍, 劉至治*, 潘連德*, 唐文喬, 王 茜#, 耿云皓#

（上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201306）

首先, 從294條10個(gè)堿基隨機(jī)引物中, 篩選出32條多態(tài)性引物, 對(duì)富春江、黃河、灤河和鴨綠江等4個(gè)松江鱸魚 (Trachidermus fasciatus)野生群體共120尾個(gè)體進(jìn)行RAPD分析。結(jié)果表明, 松江鱸魚野生群體的遺傳多樣性較豐富，其主要表現(xiàn)在：① 在擴(kuò)增得到的591個(gè)位點(diǎn)中, 有515個(gè)(87.14%)位點(diǎn)呈現(xiàn)多態(tài)性，群體間多態(tài)位點(diǎn)比率(P)的大小順序?yàn)椋焊淮航后w89.17%＞黃河群體87.99%＞鴨綠江群體86.63%＞灤河群體83.25%。② 松江鱸魚群體間的Shannon信息指數(shù)(IT)和Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(HT)分別在0.3393～0.3566和0.2157～0.2279間, 灤河群體的值較其他3群體稍低；若作為一個(gè)整體, 則總的 Shannon信息指數(shù)(IT)和Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(HT)分別為0.3710±0.2153和0.2336±0.1643。③ 雖然群體間基因流值(Nm)在5.76103～19.84497間, 顯示各地理群體間存在程度不同的基因交流, 但分子方差分析(AMOVA)結(jié)果卻表明, 各群體間存在顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)的遺傳分化。④ 聚類分析表明, 鴨綠江群體首先與黃河群體聚為一支, 再與富春江群體相聚, 最后與單獨(dú)一支的灤河群體聚類, 表明鴨綠江、黃河、富春江等3群體間的遺傳距離與彼此間的地理距離遠(yuǎn)近密切相關(guān), 而灤河群體與它們的遺傳距離較遠(yuǎn)。其次, 從獲得的S1225525bp、S1225605bp、S1225841bp、S1345695bp、S1345825bp等5個(gè)特異RAPD條帶中, 成功地由S1225605bp、S1225841bp條帶分別轉(zhuǎn)化出SCAR01560bp、SCAR02443bp的SCAR標(biāo)記。這兩個(gè)標(biāo)記的出現(xiàn)頻率, 在鴨綠江群體最高(96.67%和93.33%)、富春江群體其次(83.33%和90%)、黃河群體再其次（56.67%和66.67%)、灤河群體最低(13.33%和20%)。因此, SCAR01560bp、SCAR02443bp可作為鑒別松江鱸魚灤河群體與其他3群體的分子標(biāo)記。

松江鱸魚; 遺傳多樣性; RAPD; SCAR標(biāo)記

松江鱸魚 (Trachidermus fasciatus, Heckel)隸屬于鲉形目(Scorpaeniformes)杜父魚科(Cottidae)松江鱸魚屬(Trachidermus), 俗稱“四鰓鱸”等, 是一種降海溯河洄游性魚類(Hubei Institute of Hydrobiology Laboratory of Ichthyology, 1976)。它個(gè)體不大, 但自古被譽(yù)為佳品, 其分布曾被認(rèn)為僅局限于長江口咸淡水域及附近小河中(Hubei Institute of Hydrobiology Laboratory of Ichthyology, 1976);不過, 最近Wang (2006)報(bào)道, 該魚從日本南部、朝鮮西南部到中國東部沿海及相鄰淡水水域都有分布。在中國, 隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展, 因氣候變化、環(huán)境污染及水利設(shè)施的修建等諸多因素的影響, 松江鱸魚資源日益枯竭、種群瀕危, 已于1988年被列為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物 (Wang & Liang,2008)。進(jìn)入21世紀(jì)以來, 先后有研究者從形態(tài)、生化遺傳到分子水平上對(duì)松江鱸魚的種質(zhì)資源進(jìn)行了分析(Liu et al, 2010; Wang et al, 2001, 2002; Wang & Liang, 2008; Xu et al, 2008, 2009), 但這些報(bào)道受限于野生個(gè)體難覓等原因, 研究結(jié)果尚難以全面、客觀地反映中國現(xiàn)有松江鱸魚野生種群的遺傳多樣性現(xiàn)狀; 另一方面, 關(guān)于松江鱸魚種群分化問題, 研究者的觀點(diǎn)也不盡一致(Liu et al, 2010; Wang et al, 2001, 2002; Wang & Liang,2008; Xu et al, 2008, 2009)。因此, 采用其他分子標(biāo)記方法, 從不同側(cè)面進(jìn)一步探討這些問題十分必要。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技術(shù)是由Wiliams et al(1990)和Welsh et al(1990)提出的一種具有簡單、快速、高效等特點(diǎn)的分子標(biāo)記, 已被廣泛地應(yīng)用于生物的親緣關(guān)系、遺傳多樣性、群體遺傳、種質(zhì)鑒定等多方面的研究(Barman et al, 2003; Gao et al, 2007; Yan et al, 2005)。序列特定擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記(sequence characterized applied region, SCAR)是在RAPD技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種可靠、穩(wěn)定、可長期利用的標(biāo)記技術(shù), 因其具有穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性高等特點(diǎn), 已被國內(nèi)外研究者廣泛應(yīng)用于大西洋鮭(Salmo salar)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Zhang et al, 2007)、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala) (Zou et al, 2005)、“新吉富”尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)(Li et al, 2010)、甌江彩鯉(Cyprinus carpiovar. color)(Lu et al, 2011)、奧利亞羅非魚(Oreochromis aureus)(Gao et al, 2008)等許多水產(chǎn)動(dòng)物的群體間特異性分子標(biāo)記或品系鑒別。本研究采用RAPD-SCAR分析方法, 既從核基因組角度分析松江鱸魚的群體遺傳多樣性, 又力求尋找地理群體間的分子標(biāo)記, 為松江鱸魚種質(zhì)資源的保護(hù)與利用、種群鑒別提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的野生松江鱸魚樣本, 分別采自浙江富春江(簡稱富春江群體, 用FR表示)、山東黃河入海口(簡稱黃河群體, 用YR表示)、河北灤河(簡稱灤河群體, 用LR表示)、遼寧鴨綠江(簡稱鴨綠江群體, 用YL表示)。每個(gè)群體均采集活魚30～40尾,剪取約0.2 g右胸鰭, 放入1.5 mL離心管中, 先用95%酒精保存48 h后, 換用75%酒精保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用常規(guī)的“酚-氯仿”法, 參照文獻(xiàn)(Liu et al, 2009)的方法進(jìn)行。提取的DNA于?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RAPD-PCR擴(kuò)增 10 堿基隨機(jī)引物294條(引物編號(hào)為S11-S40、S122-S185、S1210-S1409), 購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。參照說明書配置濃度 5 μmol/L, ?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系25 μL：包括含2.5 μL buffer、1 μL dNTPs (2.5 μmol/L), 引物2 μL、2μL基因組DNA、0.6 μLTaqDNA聚合酶(北京艾德萊生物科技有限公司, 5 U/μL)、16.9 μL去離子水(天根生化有限公司)。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃變性45 s、36℃退火45 s、72 ℃延伸90 s, 45個(gè)循環(huán)后, 72 ℃延伸10 min。所有PCR 反應(yīng)均在Mastercycler ep gradient S (Eppendorf)型PCR儀上進(jìn)行。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 經(jīng)凝膠(含EB 0.5 μg/mL)電泳(5 V/cm)1.5 h后, 用BIO-RAD Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 經(jīng)電泳獲得的RAPD 圖譜, 在同一電泳遷移位置上, 有 RAPD 擴(kuò)增條帶的計(jì)為1, 沒有的計(jì)為 0, 將每群體所有個(gè)體在全部位點(diǎn)上的譜帶式樣組成一個(gè)“0或 1”矩陣。在假定Hardy-Weinberg平衡下, 用POPGENE 32軟件進(jìn)行分析, 計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)比例(P)、Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(HT)、Shannon 信息指數(shù)(IT)、群體間遺傳相似度及群體間遺傳距離等。根據(jù)群體間的遺傳距離, 用MEGA4.0 (Tamura et al, 2007)軟件包中的“UPGMA”程序?qū)?個(gè)群體進(jìn)行聚類分析, 用Arlequin 3.0(Excoffier et al, 2005) 軟件進(jìn)行分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA), 計(jì)算遺傳分化指數(shù)(Fst)。

1.2.4 RAPD產(chǎn)物的克隆 利用 DNA 快速回收試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司), 從1.8%瓊脂糖凝膠中回收純化RAPD特異片段。將純化片段連接到pMD19-T Vector載體(TaKaRa公司), 然后轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細(xì)胞(天根生化有限公司)。根據(jù)藍(lán)白斑原理, 挑選白色菌落進(jìn)行搖菌, 用M13+/-引物做菌落PCR、篩選鑒定陽性克隆, 每個(gè)個(gè)體挑選3個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥有限公司)。

1.2.5 SCAR標(biāo)記的篩選 將RAPD擴(kuò)增產(chǎn)生的特異性條帶回收并克隆、測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果, 用Primer Premier3.0(Rozen & Skaletsky, 2000)軟件設(shè)計(jì)19～25 bp的正反引物, 先經(jīng)小樣本(每群體8個(gè)體)PCR篩選, 對(duì)仍能擴(kuò)增出目的條帶的引物再進(jìn)行大樣本(每群體30個(gè)體)驗(yàn)證。PCR 擴(kuò)增參數(shù)基本與RAPD分析保持一致, 但退火溫度稍做變動(dòng)(表1)、循環(huán)次數(shù)減為35個(gè)。

2 結(jié) 果

2.1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果

本研究從294條10堿基隨機(jī)引物中, 篩選出32條擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好的引物(圖1), 對(duì)4個(gè)松江鱸魚群體進(jìn)行RAPD分析。獲得的總位點(diǎn)數(shù)為591個(gè), 其中多態(tài)位點(diǎn)數(shù)515個(gè)(87.14%), 平均每條引物產(chǎn)生18.46個(gè)位點(diǎn), 擴(kuò)增片段大小集中在200～2 500 bp間。松江鱸魚群體間的多態(tài)性位點(diǎn)比例(P)的大小順序?yàn)椋焊淮航后w(FR)89.17%＞黃河群體(YR)87.99%＞鴨綠江群體(YL)86.63%＞灤河群體(LR)83.25%。

表1 SCAR標(biāo)記的引物序列、退火溫度及擴(kuò)增片段大小Tab. 1 Primer sequence, annealing temperature and size of PCR band of SCAR markers

圖1 引物S1255(A)和S1345(B)的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 The amplification results of primer S1255 (A) and S1345(B)

在4群體間, 共獲得5條特異性RAPD擴(kuò)增帶(圖1A，B, 箭頭所指)。其中, 引物S1255有3條特異性帶：條帶S1255525bp在FR、YL兩群體的出現(xiàn)率很低, 僅6.67%, 即只有2個(gè)體檢測(cè)到此位點(diǎn), 而在YR、LR群體卻較高, 分別為23.33%、76.67%; 與此相反, 條帶S1255605bp在FR、YL兩群體的出現(xiàn)率(90%、93.33%)最高, 而在YR群體為73.33%、在LR群體僅13.33%; 條帶S1255841bp在4群體間的出現(xiàn)頻率與S1255605bp類似, 大小順序?yàn)椋篩L (96.67%)＞FR (90%)＞YR (83.33%)＞LR(13.33%)。引物S1345有2條特異性帶：S1345695 bp和S1345825 bp, 其出現(xiàn)率在YL群體均為100%, 在FR和YR兩群體均為93.33%, 而在LR群體中卻只有16.67%。

2.2 群體遺傳多樣性與遺傳分化

4個(gè)松江鱸魚群體間的Shannon信息指數(shù)(IT)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(HT)分別在0.3393～0.3566和0.2157～0.2279間(表2)。比較而言, LR群體的值較其它3群體稍低。若將4群體看成一個(gè)整體, 則總?cè)后w的Shannon信息指數(shù)(IT)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(HT)分別為0.3710±0.2153、0.2336±0.1643?？梢?松江鱸魚群體的基因多樣性較高。

表2 松江鱸魚群體的Shannon信息指數(shù)(IT)和Nei’ s遺傳多樣性指數(shù)(HT)Tab. 2 Shannon’s information index (IT)and the Nei’ s genetic diversity (HT) in the populations of Trachidermus fasciatus

分子方差分析(AMOVA)結(jié)果表明(表3), 在遺傳變異的總方差中, 僅4.63%的差異來自群體間,而95.37%的差異存在于群體內(nèi)個(gè)體間。4群體總遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.0463。由表4可知, 群體間的Fst值在0.02458～0.07986間, 其中LR群體與FR、YL、YR群體的Fst值都較大, YR、YL群體間的Fst值最小(0.02458), 群體間存在顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)的遺傳分化。不過, 由基因流值(Nm)的大小可知, 各地理群體間均存在一定程度的基因交流,其中YR、YL群體間的Nm最強(qiáng)(19.84497), 而FR、LR群體Nm最弱(5.76103)(表4)。

表3 松江鱸魚群體間遺傳差異的 AMOVA分析Tab. 3 AMOVA analyses in the populations of Trachidermus fasciatus

表4 松江鱸魚群體間基因交流值(Nm, 對(duì)角線上方)與遺傳分化指數(shù) (Fst, 對(duì)角線下方)Tab. 4 The value of gene flow (Nm,above diagonal) and Genetic differentiation index (Fst,below diagonal) among the four populations of Trachidermus fasciatus

2.3 聚類分析

YR和YL群體間的遺傳相似度最大而遺傳距離最小, 分別為0.9919和0.0082; 相反, FR和LR群體間的遺傳相似度最小而遺傳距離最大, 分別為0.9757和0.0246(表5)。根據(jù)遺傳距離進(jìn)行聚類分析表明, YL群體與YR群體首先聚為一支, 然后與FR群體聚類, 最后與單獨(dú)為一支的LR群體相聚(圖2)。顯然, LR群體與其他3個(gè)群體間的遺傳距離較遠(yuǎn), 而YL、YR、FR群體間的親緣關(guān)系與彼此間地理距離的遠(yuǎn)近密切相關(guān)。

表5 群體間的遺傳相似度(對(duì)角線上方)和遺傳距離(對(duì)角線下方)Tab. 5 Genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) within or among populations of Trachidermus fasciatus

圖2 基于遺傳距離的4個(gè)松江鱸魚群體間的UPGMA聚類分析Fig. 2 Dendrogram o f the four populations of Trachidermus fasciatus by UPGMA based on genetic distance

2.4 特異性RAPD條帶的克隆、測(cè)序及SCAR標(biāo)記的建立與驗(yàn)證

對(duì)5個(gè)特異性RAPD條帶進(jìn)行測(cè)序后發(fā)現(xiàn), 它們的大小分別為520、600、840、690和820 bp左右, 與RAPD擴(kuò)增的條帶大小基本一致(圖1), 表明得到的序列是真實(shí)的目的片段。在這5個(gè)特異性條帶上成功設(shè)計(jì)了5對(duì)SCAR標(biāo)記引物, 但經(jīng)小樣本PCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn), 只有S1255605bp和S1255841bp(GenBank序列號(hào)：JN714551、JN714552)仍能擴(kuò)增出特異性目的片段(表1, 圖3), 其余3個(gè)標(biāo)記(序列未上傳)的特異性消失。又因考慮引物中G、C堿基的含量, 特異性引物的上、下游位置未從序列的兩端開始, 而是移向了序列的中間部分, 故所得的SCAR標(biāo)記SCAR01560bp、SCAR02443bp的長度分別要比對(duì)應(yīng)的RAPD標(biāo)記短(表1, 圖3)。接著, 為進(jìn)一步檢測(cè)SCAR標(biāo)記的有效性, 在松江鱸魚4群體共120尾個(gè)體中進(jìn)行大樣本驗(yàn)證。結(jié)果表明, SCAR01560bp標(biāo)記在FR、YR和YL群體的出現(xiàn)頻率分別高達(dá)83.33%(25/30)、56.67%(17/30)及96.67% (29/30); 而在LR群體的30個(gè)體中, 僅4尾具有此標(biāo)記, 出現(xiàn)頻率很低(13.33%)。同樣, SCAR02443bp標(biāo)記在FR、YL兩群體的出現(xiàn)頻率也很高, 分別為90%(27/30)和93.33%(28/30); 在YR群體的出現(xiàn)頻率也較高, 為66.67%(20/30); 但在LR群體出現(xiàn)的頻率比較低, 僅20%(6/30)?？梢? SCAR01560bp和SCAR02443bp可作為鑒別松江鱸魚LR群體與其他3群體的特異性分子標(biāo)記。

圖3 S1255605bp和S1255841bp片段的 SCAR轉(zhuǎn)化Fig. 3 SCAR bands from S1255605bp and S1255841bp markersA: SCAR01560bp; B: SCAR02443bp。 M:Marker;1～4:FR群體(FR population); 5～8:YR群體(YR population); 9～12:LR群體(LR population); 13～16:YL群體(YL population)。

3 討 論

3.1 松江鱸魚群體遺傳多樣性與種群遺傳結(jié)構(gòu)

現(xiàn)代遺傳學(xué)的觀點(diǎn)認(rèn)為, 遺傳多樣性的高低與一個(gè)物種的適應(yīng)能力、生存能力及進(jìn)化潛能密切相關(guān)。遺傳多樣性的下降, 可能導(dǎo)致物種對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的降低(Liu et al, 2009; Vrijenhoek,1994)。因此,了解瀕危物種的群體遺傳多樣性, 對(duì)其保護(hù)與管理策略的制定具有重要意義。關(guān)于松江鱸魚群體遺傳多樣性, 先后有過一些生化遺傳、分子遺傳等方面的報(bào)道。同工酶的分析結(jié)果表明, 鴨綠江流域天然種群的多態(tài)位點(diǎn)比例(10%)和平均雜合度(0.03), 在魚類中均低于平均值(Wang et al, 2002); Xu et al (2009)通過ISSR技術(shù), 發(fā)現(xiàn)松江鱸魚丹東、秦皇島群體的多態(tài)位點(diǎn)比例(44%)等遺傳指標(biāo)均較低。而Liu et al (2010)通過線粒體控制區(qū)序列的多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn), 松江鱸魚丹東、盤錦、秦皇島群體的單倍型多樣指數(shù)(Hd)維持在一個(gè)較高水平(0.989～1.00)。這些結(jié)論的不一致, 可能與作者所用同工酶多態(tài)位點(diǎn) (2個(gè))、ISSR多態(tài)性引物數(shù)量(4個(gè))及群體樣本數(shù)量(6～15尾個(gè)體)偏少有關(guān)。本研究借助RAPD技術(shù), 使用32個(gè)多態(tài)性10堿基隨機(jī)引物, 從整個(gè)基因組水平上, 對(duì)分布于較大地理范圍里的4個(gè)松江鱸魚地理種群共120個(gè)體(每群體30尾樣本)進(jìn)行分析, 結(jié)果表明，鴨綠江群體(YL)與黃河群體(YR)、富春江群體(FR)的多態(tài)位點(diǎn)比例(P)在86.63%～89.17%間, 只灤河群體(LR)略低 (83.25%)。這些值雖低于野生大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris, 93.02%～96.35%, Liu et al, 2009)、野生小黃魚(Larimichthys polyactis, 91.03%, Han et al, 2007), 但高于半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevisGüntuer, 76%～80%, Han et al, 2007)。故此, 我們認(rèn)為野生松江鱸魚的遺傳多樣性尚較豐富。

種群遺傳結(jié)構(gòu)是指遺傳多樣性在群內(nèi)、群間的分布, 即遺傳分化。種群遺傳結(jié)構(gòu)可反映種群大小、繁育系統(tǒng)、隔離程度和遷徙格局的時(shí)空動(dòng)態(tài)。分化是種群偏離共同祖先所經(jīng)歷的進(jìn)化過程, 反映了種群間遺傳差異的大小和距離的遠(yuǎn)近。環(huán)境為種群分化提供了特定場(chǎng)所, 自然選擇使分化得以實(shí)現(xiàn)(Tang et al, 2011)。關(guān)于松江鱸魚種群分化問題, 先后有些零星的報(bào)道。從表型性狀上看, Wang et al (2008)發(fā)現(xiàn), 松江鱸魚鴨綠江、青龍河和富春江等3個(gè)群體的分化雖未達(dá)到亞種水平, 但鴨綠江群體與其它兩個(gè)群體的差異較大。在分子水平上, AFLP和ISSR(Xu et al, 2008; 2009)的分析結(jié)果表明, 松江鱸魚丹東群體、秦皇島群體間的分化不明顯。相反, 線粒體D-Loop區(qū)的序列分析結(jié)果則顯示, 這兩個(gè)群體間存在顯著的遺傳分化(Fst=0.1422,P＜0.05), 而盤錦群體與它們間的分化卻不明顯(P＞0.01) (Liu et al, 2010)。上述觀點(diǎn)的不盡一致, 應(yīng)與研究者所采用分析方法靈敏度的不一、樣本數(shù)量多少不等及采樣群體地理位置的遠(yuǎn)近等等有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn), 雖然松江鱸魚4個(gè)地理群體間的Fst值(0.02～0.08間)不是很大, 但這些群體間卻都存在顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)的遺傳分化, 特別是LR與YL、LR與FR群體間的Fst值(0.05903和0.07986)較大, 揭示灤河群體與鴨綠江、富春江群體間的分化已達(dá)到Wright (1978)標(biāo)準(zhǔn)的中等程度。這一結(jié)果與Wang et al (2008)的形態(tài)研究結(jié)果相符, 也與Liu et al (2010)報(bào)道的線粒體分析結(jié)果部分的一致。不過需要指出的是, 本研究的4個(gè)群體間的基因交流值(Nm=5～20＞4)都比較大, 特別是YL、YR、FR群體間的基因交流值更大(12～20), 表明它們間的基因交流較為頻繁, 這可能掩蓋了各群體間固有的部分遺傳差異, 從而影響了彼此間遺傳分化指數(shù)的大小。松江鱸魚繁殖期間及其幼魚在近海岸生長階段, 季節(jié)性海洋沿岸流增加了不同地理種群間的混雜與基因交流的機(jī)會(huì), 特別是地理位置相對(duì)較近、同屬于黃海海區(qū)的YR和YL群體, 這種交流更易發(fā)生。

在UPGMA聚類圖中(圖2), YL、YR、FR群體間的關(guān)系與彼此地理位置的遠(yuǎn)近相一致, 呈現(xiàn)出從北到南的分布格局, 而LR群體與它們的親緣關(guān)系都較遠(yuǎn), 顯示出明顯的遺傳差異。

3.2 SCAR標(biāo)記的應(yīng)用

由特異性的RAPD條帶轉(zhuǎn)化而來的SCAR標(biāo)記,克服了RAPD重復(fù)性欠佳的弱點(diǎn), 已被廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種、種質(zhì)鑒定等方面(Li et al, 2010; Lu et al, 2011; Zou et al, 2005)。本研究由S1255605bp和S1255841bp兩條RAPD特異性條帶成功轉(zhuǎn)化出SCAR01560bp和SCAR02443bp的SCAR標(biāo)記。大樣本檢測(cè)表明, 它們的出現(xiàn)頻率在YL、FR群體都很高(83%～97%), 在YR群體比較高(56%～67%), 而在LR群體卻很低(13%～20%)。因此, SCAR01560bp和SCAR02443bp可作為鑒別灤河群體與其他3群體的分子標(biāo)記。至于這兩個(gè)標(biāo)記與什么性狀相關(guān)聯(lián),有待以后的研究來證實(shí)。有趣的是, 在每群體的30尾樣本中, YL、FR群體未出現(xiàn)這兩個(gè)標(biāo)記的樣本數(shù)(1～2和3～5個(gè)), 恰與LR群體出現(xiàn)這兩個(gè)標(biāo)記的樣本數(shù)(4～6個(gè))接近。若假設(shè)這些個(gè)體恰好在3群體間發(fā)生了互換, 則YL、FR群體出現(xiàn)與LR群體不出現(xiàn)標(biāo)記的頻率幾乎達(dá)到100%。LR群體的養(yǎng)殖性能較其他海區(qū)的差(Pan et al, 2010), 在4群體中的遺傳多樣性最低、UPGMA聚類樹中與其他群體的關(guān)系最遠(yuǎn)等, 都揭示該群體具有自身的遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 推測(cè)渤海灣海區(qū)內(nèi)可能存在松江鱸魚的獨(dú)立產(chǎn)卵場(chǎng), 值得深入調(diào)查。

本研究的另外3個(gè)RAPD標(biāo)記, 經(jīng)克隆、測(cè)序后, 雖曾設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證, 但都未能成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。類似的現(xiàn)象在鯉(Gao et al, 2007)、團(tuán)頭魴(Zou et al, 2005)、奧利亞羅非魚(Gao et al, 2008)的SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化中都存在。究其原因可能是：(1)S1255525 bp、S1345695 bp和S1345825 bp片段在基因組中可能是高度重復(fù)序列, 在轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記時(shí)特異性消失; (2)若產(chǎn)生 RAPD 特異性位點(diǎn)發(fā)生在隨機(jī)引物的退火區(qū), 用隨機(jī)引物進(jìn)行 RAPD擴(kuò)增時(shí)發(fā)生錯(cuò)配, 退火不良而不能擴(kuò)增, 而隨機(jī)引物 3'端增加了 9～15個(gè)堿基后, 在非特異性區(qū)提供了足夠的同源性, 克服了最初的錯(cuò)配允許引物退火擴(kuò)增,使原有的特異性消失(Gao et al, 2007; Xu et al, 1995); (3)也可能是特異RAPD帶位于引物的 3'端或者與基因的遺傳距離較遠(yuǎn), 連鎖不緊密造成的(Gao et al, 2007)。

接下來, 我們將著力尋找YL、YR、FR群體間的特異性分子標(biāo)記, 為松江鱸魚天然種質(zhì)資源庫的保護(hù)提供分子水平上的鑒定手段。

致謝：遼寧省水產(chǎn)苗種管理局檢疫檢測(cè)中心唐作鵬研究員、丹東市水產(chǎn)技術(shù)推廣站梁天紅高級(jí)工程師、山東省墾利縣周輝先生和浙江省杭州市金良庭先生協(xié)助采集松江鱸魚樣品, 上海海洋大學(xué)王成輝教授和本校水產(chǎn)與生命學(xué)院的2009級(jí)李雪松、馬召騰幫助處理數(shù)據(jù), 在此一并致謝。

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Analysis of genetic diversity in wild populations ofTrachidermus fasciatusby RAPD and the transformation of two SCAR markers

ZENG Zhen, LIU Zhi-Zhi*, PAN Lian-De*, TANG Wen-Qiao, WANG Qian#, GENG Yun-Hao#

(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources Certificated by Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Firstly, RAPD was conducted to analyze genetic diversity ofTrachidermus fasciatusin the Fuchun River population (FR), Yellow River population (YR), Luan River population (LR), and Yalu River population (YL), with 32 polymorphic 10-bp random primers selected from 294 ones. Thirty wild individuals were detected in each population. The results indicated that the genetic diversity ofT.fasciatuswas relatively rich. The major results were as the following: 1) Altogether, 591 bands were detected and 515 of them were polymorphic, accounted for 87.14%. The range of proportion of polymorphic loci (P) was: FR(89.17%)＞YR(87.99%)＞YL(86.63%)＞LR(83.25%). 2) The Shannon’s information index(IT) and Nei’s genetic diversity(HT) among populations were 0.3393?0.3566 and 0.2157?0.2279, respectively. Compare to other three populations, LR population had relative lower values. If took the populations as a whole, the total Nei’s genetic diversity(HT) and Shannon’s information index(IT) was 0.2336±0.1643 and 0.3710±0.2153, respectively. 3) The value of gene flow (Nm) (5.76103?19.84497) were high, indicating certain gene exchange existedamong the four populations. But the AMOVA results exhibited significantly differentiation (P＜0.05 orP＜0.01) among the populations. 4) In the UPGMA tree constructed according to genetic distance, YL and YR populations clustered firstly, then with FR population, and finally they joined to LR population. Obviously, the YL, YR and FR populations had relatively close relationship according to their geographic distance, whereas LR population showed clear divergence to the other three populations. Secondly, out of the five special RAPD bands (S1225525bp, S1225605bp, S1225841bp, S1345695bpand S1345825bp), SCAR maker SCAR01560bpand SCAR02443bpwere successfully transformed from S1255605bpand S1255841bp, respectively. After large samples examination of the two markers, we found the highest frequency (96.67% and 93.33%) in the YL population, higher frequency (83.33% and 90%) in the FR population, high frequency (56.67% and 66.67%) in the YR population, and the lowest frequency (13.33% and 20 %) in the LR population. Therefore, SCAR01560bpand SCAR02443bpcan be used as special molecular markers for the population identification between LR and other three populations.

Trachidermus fasciatus; Genetic diversity; RAPD; SCAR marker

Q959.483; Q343

A

0254-5853-(2012)02-0203-08

10.3724/SP.J.1141.2012.02203

2011-11-03；接受日期：2012-02-14

上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科(海洋生物學(xué))建設(shè)項(xiàng)目(J50701);上海市科技興農(nóng)項(xiàng)目(滬農(nóng)科推字2006-3-5);上海市水生生物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(S30701);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(Y1101)

?通信作者(Corresponding authors)，E-mail: zzliu@shou.edu.cn; ldpan@shou.edu.cn

#2007生物科學(xué)(海洋生物方向本科生)

曾珍(1987-),女,江西撫州人,碩士研究生。專業(yè)方向?yàn)轸~類分子進(jìn)化與免疫遺傳學(xué)。E-mail:zengzhen2010@126.com