吳建力 杜華榮 尹耕心 吳玉鵬 傅克勤

安徽省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所(合肥，230031)

MLPA技術(shù)用于產(chǎn)前DMD基因診斷的應(yīng)用探討

吳建力 杜華榮 尹耕心 吳玉鵬 傅克勤*

安徽省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所(合肥，230031)

假肥大性肌營養(yǎng)不良癥是一種嚴(yán)重的神經(jīng)肌肉疾病，分為杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)和貝氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥 (BMD)，均是由于 DMD基因(Xp21.2)突變所致［1］。由于本病目前無有效的治療方法，產(chǎn)前診斷成為控制致病基因傳遞、防止患兒出生及降低發(fā)病率的主要措施。本研究對DMD產(chǎn)前診斷家系中具有高患病風(fēng)險(xiǎn)的2個(gè)胎兒，提取其羊水基因組DNA，采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷的探索。

1 資料與方法

1 1 一般資料

2例均為進(jìn)行DMD基因診斷，經(jīng)MLPA技術(shù)確診為DMD基因外顯子缺失者，其母親再次妊娠，經(jīng)超聲性別檢查胎兒均為男性，有50%患DMD風(fēng)險(xiǎn)，要求對胎兒進(jìn)行DMD基因產(chǎn)前診斷。對標(biāo)本的使用均知情同意。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA提取采集2例患兒及父母外周靜脈血3～4ml至含EDTA抗凝劑的采血管中。抽取孕16～22周婦女羊水20ml，均使用基因組DNA提取試劑盒(QIAamp Blood DNA mini Kit)抽提DNA，加入適量的TE液，充分溶解DNA，紫外分光光度計(jì)測定DNA純度和濃度。將DNA濃度控制在50 ～200ng/μl，－20℃保存。

1.2.2 MLPA檢測MLPA檢測試劑盒 P034/P035購自MRC Holland。①基因組DNA變性和SALSA MLPA探針雜交:取約100ng(3μl)的基因組DNA，將其95℃變性5min，25℃保溫，然后向變性后的DNA中分別加入MLPA探針混合物和MLPA緩沖液，小心混勻，95℃ 孵育1 min，60℃過夜雜交15h以上。②連接反應(yīng):冷卻至54℃后，再加入連接緩沖液A、B和連接酶，小心混勻，54℃孵育15min，98℃加熱5 min終止連接反應(yīng)，4℃保溫。③PCR反應(yīng):由SALSA FAM PCR引物、SALSA PCR緩沖液、水和SALSA聚合酶配制的SALSA PCR體系9.8μl中加入 2.7μl連接產(chǎn)物，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃60s，循環(huán)35次，72℃延伸20min。④毛細(xì)管電泳檢測:0.5μl PCR 產(chǎn)物與 0.15μl Genescan LIZ500 和10μl去離子甲酰胺混合，在ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer上經(jīng)36cm毛細(xì)管電泳分離，溫度控制在60℃。3130 Data Collection Software(Applied Biosystems)收集數(shù)據(jù)，用GeneMapper ID v3.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每次MLPA檢測都包括一個(gè)正常的對照樣本，檢測結(jié)果均經(jīng)過2次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

2 結(jié)果

采用SALSA probe mix P034和P035兩套探針可同時(shí)檢測DMD基因79個(gè)外顯子缺失型和攜帶者。

2.1 家系1

見圖1、圖2。先證者(患病者)是DMD 45號外顯子缺失突變，母親為攜帶者:45號外顯子雜合缺失突變，胎兒為一正常男性胎兒。

2.2 家系2

見圖3，圖4。先證者是DMD 46～53號外顯子缺失突變，母親為DMD 45～53號外顯子雜合缺失突變，胎兒為一正常男性胎兒。

3 討論

假性肥大性肌營養(yǎng)不良為性染色體隱性遺傳。DMD患者一般有典型臨床表現(xiàn)和家族史，約1/3為散發(fā)型，男性患病，女性攜帶。BMD起病較晚，癥狀較輕且進(jìn)展緩慢，多在16歲之后靠輪椅生活，壽命可達(dá)40～50歲。血清生化檢測是確定DMD/BMD攜帶者及患者的傳統(tǒng)方法，肌酶在疾病早期和進(jìn)展期均明顯增高，尤以血清肌酸磷酸激酶最敏感。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對疑似DMD進(jìn)行準(zhǔn)確的基因診斷可以避免誤診和誤治，給患者提供更加詳細(xì)準(zhǔn)確的優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)。

1868年Duchenne首次描述此病，同年Monaco等首次將DMD基因定位于Xp21.2，1987年Koenig等克隆了整個(gè)DMD基因約14kb的cDNA。DNA全長為2.4Mb，RNA 全長為 14.2Kb，含有 79 個(gè)外顯子，占X染色體全長的1.5%，包含79個(gè)外顯子和78 個(gè)內(nèi)含子，是目前發(fā)現(xiàn)的人類最大的基因［2，3］。在DMD基因內(nèi)存在許多重復(fù)序列，有許多斷裂和交換熱點(diǎn)，導(dǎo)致基因缺失/重復(fù)極容易發(fā)生新生突變。DMD基因具有突變長度不一、突變位置無固定規(guī)律等特點(diǎn)，突變無明顯種族、地理差異，突變中以外顯子缺失突變最常見(55% ～65%)［4］。

White等［5］2002年設(shè)計(jì)了多重可擴(kuò)增探針雜交技術(shù)(MAPH)，同年 Schouten等［6］在 MAPH 技術(shù)的基礎(chǔ)上又發(fā)展了一種快速簡單的檢測技術(shù)，即MLPA。MLPA可以用2套引物通過2次 PCR檢測DMD基因79個(gè)外顯子缺失或重復(fù)，具有需要DNA量小、靈敏度高和重復(fù)檢測的優(yōu)點(diǎn)，是一種檢測DMD/BMD基因大片段缺失/重復(fù)的快速可靠方法，通過直觀圖譜進(jìn)行檢測結(jié)果分析［7］。變性高效液相色譜(DHPLC)對DMD的基因缺失重復(fù)進(jìn)行檢測，其他還可以利用高分辨溶解曲線、基因芯片、免疫組化等方法檢測DMD基因的突變類型［8］。

由于DMD涉及基因突變類型多，不同家系的突變類型可完全不同，需采用不同基因診斷方法和策略，因此在擬開展DMD的產(chǎn)前診斷之前必須首先完成家系中先證者的臨床確診和基因診斷，進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷才有意義。本所現(xiàn)階段僅對DMD外顯子缺失突變的先證者家系中具有髙致病風(fēng)險(xiǎn)的胎兒運(yùn)用MLPA技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。通常先運(yùn)用MLPA技術(shù)檢測先證者及家系中其他患者的DMD基因所有外顯子，在明確存在DMD基因缺失型突變，確定缺失外顯子片段后，再對家系中的高風(fēng)險(xiǎn)致病胎兒進(jìn)行針對同一片段的基因診斷。本文通過對2個(gè)家系的基因診斷，2個(gè)家系中的高致病風(fēng)險(xiǎn)胎兒檢測均未見DMD外顯子明顯缺失后，先證者母親繼續(xù)妊娠至胎兒分娩，取嬰兒血液經(jīng)MLPA檢測證實(shí)與用羊水的檢測結(jié)果一致。嬰兒經(jīng)產(chǎn)科及兒科醫(yī)生體檢，未見明顯異常臨床表現(xiàn)。進(jìn)行血清酶學(xué)檢查及后期隨訪，也沒有發(fā)現(xiàn)異常臨床體征。如DMD外顯子篩查未發(fā)現(xiàn)缺失位點(diǎn)，則需開展先證者、先證者父母及家庭其他成員的DMD基因連鎖標(biāo)志分析，確定家系突變DMD基因類型，而后建立相應(yīng)的基因診斷技術(shù)［9，10］。這是本所下一階段爭取開展的項(xiàng)目研究，不僅可以降低發(fā)病率，而且可以檢測胎兒是否為基因攜帶者，從而有效控制致病基因的傳遞。

1 Francesco Muntoni，Silvia Torelli，Alessandra Ferlini，et al.Dystrophin and mutations:one gene，several proteins，multiple phenotypes［J］.The Lancet Neurology，2003，2(12):731 －740.

2 Monaco AP，Neve RL，Colletti－ Feener，et al.Isolation of candidate cDNAs for portions of the Duchenne muscular dystrophy gene ［J］.Nature，1986，(6089)323:646 －650.

3 Koenig M，Hoffman EP，Berteison CJ，et al.Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy(DMD)cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals［J］.Cell，1987，50(3):509 －517.

4 Mendell J R，Buzin CH，F(xiàn)eng J，et al.Diagnosis of Duchenne dystrophy by enhanced detection of small mutations［J］.Neurology，2001，57:645－650.

5 White S，Kalf M，Liu Q，et al.Comprehensive detection of genomic duplications and deletions in the DMD gene，by use of multiplex amplifiable probe hybridization［J］.The American journal of human genetic，2002，71(2):365 －368.

6 Schouten JP，McElgunn CJ，Wanijer R，et al.Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation－dependent probe amplification［J］.Nucleic Acids Resarch，2002，30(12):1 －13.

7 吳玉鵬，吳德，尹耕心，等.MLPA和PCR－RFLP技術(shù)用于脊髓性肌萎縮癥的基因診斷［J］.中國計(jì)劃生育學(xué)雜志，2008，16(9):535－539.

8 古艷，謝建生，韓春錫，等.應(yīng)用多重連接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)對脊髓性肌萎縮患者及致病基因攜帶者進(jìn)行基因診斷［J］.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2010，4(9):1512 －1519.

9 蒲祥元，金帆.Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥的植入前遺傳學(xué)診斷［J］.國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2009，28(5):324 －325.

10 LI Q，Li SY，Hu DG，et al.Prenatal molecular diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，38(1):53 －56.

2012－05－11

2012－07－06*

jhsykys@163.com

［責(zé)任編輯:張 璐］