龐 迪，史鳳雪，李志瑞，崔 娜，孫明洲，李霖鋒，肖洪興

（1.東北師范大學(xué)分子表觀遺傳學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130024；

2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024）

尖萼耬斗菜的傳粉機(jī)制與遺傳結(jié)構(gòu)

龐 迪1，2，史鳳雪1，2，李志瑞1，2，崔 娜2，孫明洲2，李霖鋒1，2，肖洪興1，2

（1.東北師范大學(xué)分子表觀遺傳學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130024；

2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024）

對(duì)尖萼耬斗菜（AquilegiaoxysepalaTrautv.et C.A.Mey.）及其變型黃花尖萼耬斗菜（A.oxysepalaf.pallidiflora（Nakai）Kitag）進(jìn)行了傳粉生物學(xué)與遺傳結(jié)構(gòu)研究.結(jié)果表明，雖然尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的繁殖系統(tǒng)沒有差異，但其傳粉高峰期已經(jīng)產(chǎn)生分化.其次，SSR數(shù)據(jù)顯示這二者的遺傳結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了分化，為將來進(jìn)一步研究其種內(nèi)的微分化奠定了基礎(chǔ).

毛茛科；尖萼耬斗菜；繁殖系統(tǒng)；傳粉；遺傳結(jié)構(gòu)

尖萼耬斗菜（AquilegiaoxysepalaTrautv.et C.A.Mey.）隸屬于毛茛科（Ranunculaceae）耬斗菜屬（Aquilegia），多年生草本；該屬共有約70個(gè)物種，廣泛分布于歐洲、北美與亞洲等地區(qū)［1－3］.已有的研究顯示，耬斗菜屬大約于600萬年前起源于亞洲北部，然后于300萬年前分別擴(kuò)散至北美與歐洲等地區(qū)，并隨后產(chǎn)生了適應(yīng)性輻射.其中導(dǎo)致歐洲耬斗菜屬物種輻射成種的主要原因是生態(tài)位（niche）的變遷，而導(dǎo)致北美地區(qū)耬斗菜屬物種輻射成種的主要原因是傳粉者（pollinator）的改變［4］.由此可知耬斗菜屬是研究物種形成與適應(yīng)性進(jìn)化的優(yōu)良材料.

根據(jù)《中國植物志》，我國東北地區(qū)約有7個(gè)耬斗菜屬物種，其中尖萼耬斗菜為該屬在東北地區(qū)最為常見的物種之一，其種內(nèi)包括尖萼耬斗菜（A.oxysepala）及其變型黃花尖萼耬斗菜（A.oxysepalaf.pallidiflora（Nakai）Kitag）.二者在形態(tài)學(xué)上的主要區(qū)別為尖萼耬斗菜花瓣尖端為黃色，距和萼片為紫色；而黃花尖萼耬斗菜的距和萼片均為黃色［5］.Bradshaw和Schemske等（2003）曾對(duì)Mimulus cardinalis和M.lewisii進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)花顏色的改變對(duì)傳粉者種類的變化起著較大的作用［6］.隨后，Hodges和Nathan等（2009）通過對(duì)北美地區(qū)的耬斗菜屬物種進(jìn)行的相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)了耬斗菜屬各物種花顏色的改變對(duì)其傳粉系統(tǒng)以及物種分化起著關(guān)鍵的作用［7］.

鑒于花色的改變?cè)谖锓N進(jìn)化過程中所扮演的重要作用，本文分別對(duì)尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的傳粉機(jī)制進(jìn)行了研究.此外，運(yùn)用簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）技術(shù)對(duì)尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析，以期揭示花顏色的改變對(duì)二者傳粉系統(tǒng)與遺傳結(jié)構(gòu)的影響.

1 材料與方法

1.1 傳粉生物學(xué)研究

1.1.1 樣地的選擇與套袋實(shí)驗(yàn) 選取撫松縣露水河鎮(zhèn)的永清林場與21林班為研究地點(diǎn)，分別對(duì)尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的花進(jìn)行套袋處理，具體操作如下：在同一植株中選擇部分花粉尚未成熟的花進(jìn)行套袋，其余部分的花則讓其自然生長，檢測它們的繁殖系統(tǒng)（mating system）.

1.1.2 傳粉過程觀察 自8：00～17：00分別對(duì)尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜進(jìn)行傳粉生物學(xué)觀察，并以30min為單位對(duì)傳粉者的種類、傳粉的次數(shù)以及方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì).同時(shí)，捕獲部分傳粉者作為實(shí)驗(yàn)的憑證.

1.2 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.1 樣品的收集與DNA的提取 廣泛收集分布于長白山地區(qū)的尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜，并運(yùn)用基因組DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)出品）對(duì)所收集的樣品進(jìn)行DNA提取，具體信息見表1.

居群編號(hào) 花色 個(gè)體數(shù) 采集地點(diǎn) 采集人BYG 黃色 5遼寧省冰峪溝 肖洪興紫色 5 DH 紫色 5 吉林省敦化市 肖洪興黃色 3 WCH 黃色 4 黑龍江省五常市 肖洪興LBSH 黃色 3 吉林省老白山 肖洪興LKZ 紫色 5黑龍江省林口縣 肖洪興

1.2.2 PCR檢測與毛細(xì)管熒光電泳 實(shí)驗(yàn)所用的SSR引物參見文獻(xiàn)［8］，具體名稱分別是A6，A7，AA12，AA4，EST7.PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 14.4μL，10×buffer（含 Mg2＋）2μL，正引物與反引物各0.6μL，Taq酶（5U）0.2μL，DNA 50ng.反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，5min；94℃，30s；退火溫度，30s；72℃，30s；35個(gè)循環(huán)；72℃，8min.實(shí)驗(yàn)所用PCR檢測儀和毛細(xì)管熒光電泳儀型號(hào)分別為ABI2720（ABI，USA）和 ABI3730（ABI，USA）.

2 結(jié)果與分析

2.1 傳粉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 套袋實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)套袋處理的尖萼耬斗菜及其變型進(jìn)行后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于同株未套袋的對(duì)照而言，尖萼耬斗菜的自交不育率高達(dá)80.3%，而且自交可育的果實(shí)中種子的數(shù)量為非套袋果實(shí)的85.0%，說明尖萼耬斗菜的繁殖系統(tǒng)為自交親和型（self-compatible）.與此類似，黃花尖萼耬斗菜的植株經(jīng)套袋處理后，自交不育率為50%，但種子數(shù)量與對(duì)照組沒有明顯區(qū)別，因此，其繁殖系統(tǒng)也為自交親和型.由此可見，花色的改變對(duì)尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的繁殖系統(tǒng)沒有明顯的影響.2.1.2 傳粉生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過對(duì)尖萼耬斗菜及其變型的傳粉生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然它們的傳粉者種類并沒有明顯的區(qū)別，但各種傳粉者的傳粉頻率有明顯差異，如二者的蜜蜂和黑胡蜂的傳粉比例存在差異（見圖1）.此外，對(duì)各個(gè)時(shí)間段傳粉頻率的研究發(fā)現(xiàn)，尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的傳粉高峰期已經(jīng)產(chǎn)生分化，尖萼耬斗菜的傳粉高峰期分別為上午8：30—9：00和10：00—10：30，而黃花尖萼耬斗菜的傳粉高峰期分別8：00—8：30和9：00—9：30（見圖2）.

圖1 尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的傳粉者種類及其比例

圖2 尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的傳粉者訪問頻率

2.2 PCR檢測與毛細(xì)管熒光電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所獲得的5個(gè)SSR位點(diǎn)數(shù)據(jù)，分別對(duì)各個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（見表2）.根據(jù)該結(jié)果，在A6和EST7兩個(gè)位點(diǎn)上，黃花尖萼耬斗菜分別擁有獨(dú)特的等位基因，這說明其與尖萼耬斗菜的遺傳結(jié)構(gòu)已出現(xiàn)遺傳分化的趨勢(shì).此外，運(yùn)用生物軟件POPULATION對(duì)尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜進(jìn)行了系統(tǒng)樹的構(gòu)建（見圖3），結(jié)果顯示，尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的聚類關(guān)系已產(chǎn)生分化.例如，除DH1外，其余的尖萼耬斗菜個(gè)體都集中分布于A分支與B1分支中；而對(duì)于黃花尖萼耬斗菜而言，其個(gè)體并沒有依據(jù)采集地點(diǎn)發(fā)生聚類，這與表2的結(jié)果基本一致.由此可知，尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的遺傳結(jié)構(gòu)已經(jīng)有分化的趨勢(shì).

表2 尖萼耬斗菜與黃花尖萼耬斗菜各SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù) 個(gè)

3 討論

3.1 尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的傳粉生物學(xué)研究

本實(shí)驗(yàn)的套袋結(jié)果顯示，花色的變化并沒有直接導(dǎo)致尖萼耬斗菜及其變型繁殖系統(tǒng)的改變，但套袋組的結(jié)實(shí)率低于對(duì)照組.在對(duì)花的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解剖時(shí)也發(fā)現(xiàn)，最內(nèi)層的雄蕊出現(xiàn)了功能退化的現(xiàn)象.根據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步推斷尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜繁殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)特征是適應(yīng)昆蟲傳粉的結(jié)果.

在對(duì)尖萼耬斗菜及其變型的傳粉者進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，二者的傳粉者種類并沒有明顯的差異，但是每種傳粉者的訪花頻率存在差異，這與以往的研究結(jié)果類似［9］.此外，對(duì)尖萼耬斗菜及其變型傳粉高峰期的分析發(fā)現(xiàn)，二者的高峰期已經(jīng)錯(cuò)開.有研究顯示，傳粉者訪問高峰往往與植物體產(chǎn)生花粉與花蜜的高峰期是協(xié)同的［10］.基于此，我們推測尖萼耬斗菜及其變型產(chǎn)生花粉和花蜜的時(shí)間已經(jīng)分化，而導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因可能是控制花粉和花蜜產(chǎn)生的相關(guān)基因已經(jīng)開始分化.傳粉高峰期的分化會(huì)直接或者間接地導(dǎo)致尖萼耬斗菜及其變型之間基因流的減少，將增加二者之間的遺傳分化.

3.2 尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的遺傳結(jié)構(gòu)分析

圖3 尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的UPGMA樹

以往的研究顯示，傳粉系統(tǒng)的改變往往會(huì)導(dǎo)致遺傳結(jié)構(gòu)的變化［11－13］，因此，采用SSR標(biāo)記技術(shù)分別對(duì)分布于長白山地區(qū)的尖萼耬斗菜及其變型進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)的研究.結(jié)果顯示，尖萼耬斗菜及其變型的等位基因已初步產(chǎn)生分化.例如，在A6和EST7位點(diǎn)中黃花尖萼耬斗菜除了有與尖萼耬斗菜共同的等位基因外，還出現(xiàn)了一些特有的等位基因.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于這二者的傳粉系統(tǒng)產(chǎn)生了差異導(dǎo)致基因流的減少，并最終導(dǎo)致黃花尖萼耬斗菜擁有獨(dú)特的等位基因.此外，基于SSR數(shù)據(jù)構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹可知，雖然尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜并沒有完全分成兩個(gè)分支，但是這二者間也產(chǎn)生了初步的分化.綜上所述，尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的遺傳結(jié)構(gòu)已開始分化.

［1］ MUNZ P A.Aquilegia：the cultivated and wild columbines［J］.Gentes Herbarium，1946，7：1-50.

［2］ WHITTEMORE A T.Aquilegia［G］／／MORIN N R.Flora of North America.New York：Oxford University Press，1997：1-100.

［3］ NOLD R COLUMBINES.Aquilegia，ParaquilegiaandSemiaquilegia.［M］.Cambridge：Timber Press，2003.

［4］ BASTIDA J M，ALCANTARA J M，RRY P J，et al.Extended phylogeny ofAquilegia：the biogeographical and ecological patterns of two simultaneous but contrasting radiations［J］.Plant Syst Evol，2010，284：171-185.［5］ 傅沛云.東北植物檢索表（第二版）［M］.北京：科學(xué)出版社，1995：189-191.

［6］ BRADSHWA H D，SCHEMSKE D W.Allele substitution at a flower color locus produces a pollinator shift in monkeyflowers［J］.Nature，2003，426：176-178.

［7］ HODGES S A，DERIEG N J.Adaptive radiations：from field to genomic studies［J］.PNAS，2009，106：9947-9954.

［8］ LI L F，PANG D，LIAO Q L，et al.Genomic and EST microsatellite markers forAquilegiaflabellateand cross-amplification inA.oxysepala［J］.Am J Bot，2011，98（8）：213-215.

［9］ GEGEAR R J，LAVERTY T M.The effect of variation among floral traits on pollinator flower constancy and preference［G］／／CHITTKA L，THOMSON J D.Cognitive ecology of pollination：animal behavior and floral evolution.Cambridge：Cambridge University Press，2001：1-20.

［10］ GOTISBERGER G，SCHRAUWEN J，LINSKENS H F.Amino acids and sugars in nectar，and their putative evolutionary significance［J］.Plant Syst Evol，1984，145：55-77.

［11］ WILLIAMS C F，RUVINSKY J，SCOTT P E，et al.Pollination，breeding system and genetic structure in two sympatricDelphinium（Ranunculaceae）species［J］.Am J Bot，2001，88：1623-1633.

［12］ GUAN B C，F(xiàn)U C X，QIU Y X，et al.Genetic structure and breeding system of a rare understory herb，Dysosmaversipellis（Berberidaceae）form temperate deciduous forest in China［J］.Am J Bot，2010，97（1）：111-122.

［13］ KRAMER A T，F(xiàn)ANT J B，ASHLEY M V.Influences of landscape and pollinators on population genetic structure：examples from threePenstemon（Plantaginaceae）species in the Great Basin［J］.Am J Bot，2011，98（1）：109-121.

The pollination system and genetic structure ofAquilegiaoxysepalaTrautv.et C.A.Mey.

PANG Di1，2，SHI Feng-xue1，2，LI Zhi-rui1，2，CUI Na2，SUN Ming-zhou2，LI Lin-feng1，2，XIAO Hong-xing1，2

（1.Key Laboratory of Molecular Epigenetics of MOE，Northeast Normal University，Changchun 130024，China；
2.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China）

The speciesAquilegiaoxysepalaTrautv.et.C.A.Mey，which belongs to the genusAquilegiaof family Ranunculaceae，is a perennial herb and widely distributes in northeast of China.This paper analyses the pollination system and genetic structure of the speciesAquilegiaoxysepalaand its formaA.oxysepalaf.pallidiflora（Nakai）Kitag.According to the results，despite there are no obvious differences in the mating system，they exhibit differentiation in pollination peak and genetic structure.These findings provide us fundamental information for future studies of microevolution.

Ranunculaceae；Aquilegiaoxysepala；mating system；pollination；genetic structure

Q 941＋.3

180·5155

A

1000-1832（2012）01-0132-04

2010-08-22

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（10QNJJ011）.

龐迪 （1987—），女，碩士研究生；通訊作者：肖洪興（1963—），男，博士，教授，主要從事植物系統(tǒng)與進(jìn)化研究.

方 林）