宗緒巖李 麗羅惠波劉長(zhǎng)江

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

啤酒糟蛋白水解物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌能力研究

宗緒巖1李 麗1羅惠波1劉長(zhǎng)江2

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

選擇4種蛋白酶制備出不同時(shí)間水解的啤酒糟蛋白水解物，分別檢測(cè)其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力。結(jié)果表明：采用Flavourzyme水解180 min的水解物具有較好的抑制金黃色葡萄球菌的能力；采用聚酰胺柱層析、離子交換柱層析方法及凝膠柱層析方法對(duì)水解物進(jìn)行分離測(cè)定，得到分子量約為1 877.67的啤酒糟多肽樣品，其對(duì)于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為2%。

啤酒糟；蛋白酶；抗菌肽；抑菌能力；多肽

抗菌肽原有的意思是指存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界微生物侵害，并能消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類(lèi)小分子多肽［1］。這類(lèi)活性多肽多數(shù)具有熱穩(wěn)定性、耐強(qiáng)堿性以及廣譜性等特點(diǎn)［2］。最初發(fā)現(xiàn)這類(lèi)活性多肽對(duì)細(xì)菌具有殺菌活性，因而命名為抗菌肽，其原意為抗細(xì)菌肽。

近來(lái)的研究［3］發(fā)現(xiàn)使用蛋白酶水解食物蛋白也能產(chǎn)生出有效的抗菌肽：Malkoski等［4］從酪蛋白的酶解產(chǎn)物中分離得抗菌肽；夏慶和薛正蓮［5，6］采用胰蛋白酶對(duì)酪蛋白進(jìn)行水解試驗(yàn)，得到了具有較強(qiáng)抑菌效果的產(chǎn)物；Daoud等［7］用胃蛋白酶酶解牛血色素，得到有抗菌活性的肽；McCann等［8］用胃蛋白酶水解牛乳酪蛋白得到2個(gè)具有抗菌活性的肽；又用凝乳酶酶解牛乳酪蛋白得到抗菌肽［9］；Pellegrini等［10］發(fā)現(xiàn)用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶酶解鳥(niǎo)蛋蛋清中的卵清蛋白后的產(chǎn)物具有抗菌活性；Adham等［11］從雞蛋溶菌酶中獲得一種抗菌肽；Liu等［12］用堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解牡礪后得到——含半胱氨酸的抗菌肽。

本試驗(yàn)采用4種食品級(jí)商用蛋白酶對(duì)啤酒糟蛋白進(jìn)行水解，并監(jiān)測(cè)了不同水解時(shí)間水解物對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑菌能力，然后采用柱層析的方法對(duì)于活性較高的水解物進(jìn)行了分離測(cè)定，旨在制備較純的抑菌活性肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒糟蛋白：實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)［13］的方法制備；

蛋白酶 Alcalase 2.4L FG、Flavourzyme 500 MG、Neutrase 0.8L、Protamax：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；

革蘭氏陽(yáng)性菌——金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；

聚酰胺、DEAE－52、Sephadex G－50、鉻酸鉀、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、維生素B12、Nisin：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)：CR21G，Hitachi High－Technologies Corporation；

電子精密天平：BP210S，德國(guó)Sartorius AG公司；

酸度計(jì)：PHS－25型，上海雷磁儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化 將融化的培養(yǎng)基裝入試管，滅菌后擺斜面。在無(wú)菌條件下用劃線法將供試菌種移接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)行菌種斜面活化［14］。

1.3.2 供試菌株懸浮液的制備 將活化好的菌種，在無(wú)菌條件下，每種分別挑取兩環(huán)菌苔，各用無(wú)菌水稀釋?zhuān)瞥珊?07～108CFU／m L菌懸液［15］。

1.3.3 管碟法測(cè)定抑菌能力 參照文獻(xiàn)［16］的方法，并稍有改進(jìn)。在無(wú)菌條件下，在9 cm的培養(yǎng)皿中加入15 m L培養(yǎng)基，冷卻并使瓊脂表面干燥，用移液器吸取菌懸液0.5 m L，加入到培養(yǎng)皿上，用涂布器涂布均勻，于每碟中以等距放置牛津杯4只，樣品溶解過(guò)濾除菌后，取50μL在牛津杯中點(diǎn)樣，點(diǎn)樣后的平板于37℃培養(yǎng)24 h，比較抑菌效果。

1.3.4 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 參考文獻(xiàn)［17］并略有修改：將培養(yǎng)基熔化，然后定量地加入抑菌劑溶液，使提取物的濃度分別達(dá)到4%，2%，1%，0.5%，0.25%，0.125%，對(duì)照樣中分別加入等量的無(wú)菌水、氯仿、70%乙醇，充分混合均勻，傾注于平皿中。待培養(yǎng)基冷卻后，加入供試菌液，并用涂布器將供試菌液均勻涂于培養(yǎng)基表面，倒置在37℃下培養(yǎng)24 h，觀察平皿中菌體的生長(zhǎng)情況，從無(wú)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中找出對(duì)應(yīng)的最低的提取物濃度，即為該抑菌劑的最低抑菌濃度（MIC）。

1.3.5 蛋白酶水解條件 參考 Ren等［18］的方法，在200 g樣品中加入1 000 g去離子水后10 000 r／min均質(zhì)1 min，混合液等分成4份。用NaOH將調(diào)整各份至所需p H，再放入水浴搖床加熱到所需溫度后，添加6.0×104U蛋白酶同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)過(guò)程維持恒定溫度，定時(shí)監(jiān)測(cè)p H并添加NaOH使溶液p H恒定不變，記錄堿液消耗量，換算成DH值，按時(shí)間取樣1 m L沸水浴滅酶10 min后測(cè)定抑菌效果的變化，并以此確定較優(yōu)的水解用酶和較適宜的水解條件［19］。酶水解啤酒糟蛋白時(shí)具體酶解參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 酶水解啤酒糟蛋白參數(shù)Table 1 Parameters for enzymatic hydrolysis of BSG protein

1.3.6 聚酰胺柱層析 根據(jù)文獻(xiàn)［20］，精確稱(chēng)取一定量樣品干粉，溶于少量去離子水中，采用濕法上柱，緩慢加注于聚酰胺柱表面，待樣品完全滲入到固定相中時(shí)，依次加入緩沖溶液及添加了濃度分別為 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%的 NaCl的緩沖溶液，進(jìn)行步進(jìn)式洗脫?？刂葡疵撘毫魉僭?.0 m L／min，用紫外檢測(cè)器在280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)流出液的吸光值，并收集測(cè)定其抑菌能力。

1.3.7 離子交換層析 根據(jù)文獻(xiàn)［20］，精確稱(chēng)取一定量樣品干粉，溶于少量去離子水中，采用濕法上柱，緩慢加注于離子交換柱表面，待樣品完全滲入到固定相中時(shí)，依次加入緩沖溶液及添加了濃度分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%的 NaCl的緩沖溶液，進(jìn)行步進(jìn)式洗脫?？刂葡疵撘毫魉僭?.0 m L／min，用紫外檢測(cè)器在280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)流出液的吸光值，并收集測(cè)定其抑菌能力。

1.3.8 Sephadex G－50凝膠層析 分別將鉻酸鉀、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、維生素B12及Nisin按照樣品測(cè)定的方法進(jìn)行上樣和洗脫，記錄洗脫時(shí)間，并繪制出洗脫時(shí)間與分子量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照洗脫時(shí)間換算出樣品的分子量大?。?1，22］。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解度與抑菌能力的比較

對(duì)于金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽(yáng)性菌）的抑菌試驗(yàn)：Alcalase水解啤酒糟蛋白的水解物未見(jiàn)抑菌效果出現(xiàn)；Flavourzyme水解啤酒糟蛋白120 min時(shí)即出現(xiàn)抑菌效果，并維持至酶解進(jìn)行到240 min，其中在水解180 min時(shí)出現(xiàn)了明顯的抑菌效果；Neutrase水解啤酒糟蛋白的酶解物未發(fā)現(xiàn)抑菌效果；Protamax水解啤酒糟蛋白120 min時(shí)出現(xiàn)抑菌效果，但在酶解進(jìn)行到150 min時(shí)其抑菌效果消失，在水解進(jìn)行到210 min時(shí)抑菌效果再次出現(xiàn)，并在水解240 min時(shí)再次消失。

表2 不同蛋白酶水解啤酒糟蛋白的水解度和抑菌能力+Table 2 DH of BSG protein treated with various enzymes and antimicrobial activity of hydrolysate

圖1為不同蛋白酶酶解180 min時(shí)4種酶解液分別對(duì)指示菌——金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖。

由以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)和分析可知，對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好的是Flavourzyme水解啤酒糟蛋白180 min的酶解物。蛋白酶解物的抑菌效果同其水解程度呈現(xiàn)不完全對(duì)應(yīng)關(guān)系，這可能是因?yàn)樵谒膺M(jìn)行的初期，隨著水解度的增加，溶液中可溶性蛋白類(lèi)物質(zhì)量的增加，同時(shí)具有抑菌效果的組分含量也增加，因此出現(xiàn)抑菌效果；隨著水解的繼續(xù)進(jìn)行，溶液中某些具有抑菌效果的蛋白類(lèi)物質(zhì)受到蛋白酶的水解作用，某些具有抑菌效果的基團(tuán)或結(jié)構(gòu)被蛋白酶破壞或者是蛋白類(lèi)物質(zhì)的氨基酸序列發(fā)生改變，造成其抑菌效果喪失；有些情況抑菌效果隨時(shí)間延長(zhǎng)消失后會(huì)再次出現(xiàn)，這可能是由于隨著水解的進(jìn)行，某些具有抑菌能力的蛋白類(lèi)物質(zhì)或含有抑菌能力基團(tuán)的多肽被水解溶出，也有可能是因?yàn)槿芤褐械鞍最?lèi)物質(zhì)被酶作用后，具有抑菌效果的基團(tuán)或結(jié)構(gòu)再次暴露或出現(xiàn)。

圖1 酶解180 min酶解液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圖Figure 1 Enzymatic hydrolysis of 180 min on the inhibition of Staphylococcus aureus

制備Flavourzyme水解啤酒糟蛋白180 min的酶解物，冷凍干燥后備用，并分別將其命名為BSG－F3。

2.2 聚酰胺柱層析

將啤酒糟多肽樣品BSG－F3干粉溶解后濕法上柱，采用步進(jìn)式洗脫方式洗脫，洗脫液分別為緩沖溶液及添加了濃度分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%的NaCl緩沖溶液，洗脫液流速控制在1.0 m L／min，以洗脫時(shí)間為橫軸，以280 nm下流出液的吸光值及還原力為縱軸，繪制曲線圖2。

圖2 聚酰胺層析洗脫曲線Figure 2 Elution curves of polyamide chromatography

由圖2可知，用緩沖液、添加0.3%的NaCl的緩沖溶液及添加0.6%的NaCl的緩沖溶液洗脫時(shí)，均有洗脫峰出現(xiàn)，收集各峰組分，冷凍干燥然后進(jìn)行抑菌活力測(cè)定，其中0.3%的NaCl溶液洗脫后的流出液抑菌效果最好，收集此組分冷凍干燥，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并命名為BSG－F3－3。

2.3 離子交換層析

用緩沖液將啤酒糟多肽樣品BSG－F3－3干粉溶解后濕法上柱，采用步進(jìn)式洗脫方式進(jìn)行洗脫，洗脫液分別為緩沖溶液及添加了濃度分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%的 NaCl的緩沖溶液，洗脫液流速控制在1.0 m L／min，以洗脫時(shí)間為橫軸，以280 nm下流出液的吸光值及還原力為縱軸，繪制曲線圖3。

圖3 離子交換層析洗脫曲線Figure 3 Elution curves of ion－exehange chromatography

由圖3可知，用緩沖溶液、添加了0.2%的NaCl的緩沖溶液及添加了0.6%的NaCl的緩沖溶液洗脫時(shí)，均出現(xiàn)了洗脫峰，收集各峰組分，冷凍干燥然后進(jìn)行抑菌活力測(cè)定，其中添加了0.6%的NaCl的緩沖溶液洗脫后的流出液抑菌效果最好，收集此組分冷凍干燥，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，將該組分命名為 BSG－F3－3－6。

2.4 凝膠柱層析

將溶脹處理好的Sephadex G－50凝膠懸浮液緩慢傾入層析柱，待凝膠顆粒沉降后用緩沖液洗滌層析柱至穩(wěn)定和平衡。將鉻酸鉀、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、維生素B12及Nisin的干粉分別溶于少量的緩沖液中，分別上樣并記錄洗脫時(shí)間，再繪制出洗脫時(shí)間與分子量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。再將啤酒糟多肽樣品BSG－F3－3－6溶解后上樣、測(cè)定并記錄洗脫時(shí)間，按照樣品的洗脫時(shí)間計(jì)算出樣品的分子量大小。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子量與洗脫時(shí)間關(guān)系見(jiàn)表3。

以洗脫時(shí)間為自變量，分子量的對(duì)數(shù)為因變量，擬合曲線，得到如下方程：

試驗(yàn)中啤酒糟多肽樣品BSG－F3－3－6洗脫時(shí)只出現(xiàn)一個(gè)單峰，其洗脫時(shí)間為106.8 min，通過(guò)擬合曲線計(jì)算其分子量約為1 877.67。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子量與洗脫時(shí)間Table 3 Molecular weight and elution time of control sample

2.5 最小抑菌濃度測(cè)定

將不同劑量的啤酒糟多肽樣品BSG－F3－3－6分別添加到60℃左右的培養(yǎng)基中，混合均勻后傾倒平板，待培養(yǎng)基冷卻后加入金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液，涂布均勻后倒置培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)含有1%啤酒糟多肽樣品BSG－F3－3－6的培養(yǎng)皿中開(kāi)始有菌落生成，并隨著培養(yǎng)基中啤酒糟多肽樣品BSG－F3－3－6添加量的減少，菌落數(shù)逐漸增多，但在含有2%啤酒糟多肽樣品BSG－F3－3－6的3個(gè)培養(yǎng)皿中有一個(gè)出現(xiàn)了兩個(gè)菌落，重復(fù)此濃度進(jìn)行試驗(yàn)無(wú)此現(xiàn)象，因此可以認(rèn)定啤酒糟多肽樣品BSG－F3－3－6對(duì)于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為2%。

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定不同蛋白酶水解啤酒糟蛋白不同時(shí)間所生成的啤酒糟多肽樣品的抑菌能力，發(fā)現(xiàn)Flavourzyme酶解啤酒糟蛋白180 min的酶解液對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果。

使用p H為7.0的洗脫液，添加0%～0.7%NaCl溶液采用步進(jìn)式洗脫聚酰胺層析柱，并收集含0.3%NaCl洗脫液洗脫下的具有最大抑菌效果的組分。再使用p H為8.0的洗脫液，添加0%～0.7%NaCl采用步進(jìn)式洗脫離子交換層析柱（DEAE－Cellulose），并收集含0.6%NaCl洗脫液洗脫下的具有最大抑菌效果的組分。并采用Sephadex G－50凝膠柱層析方法測(cè)定其分子量約為1 877.67。分離得到的啤酒糟多肽樣品BSG－F3－3－6對(duì)于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為2%。

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Antibacterial activity ofstaphylococcus aureushydrolyzed from brewer's spent grains protein

ZONG Xu－yan1LI Li1LUO Hui－bo1LIU Chang－jiang2

（1.College of Bioengineering，Sichuan University of Science ＆ Engineering，Zigong，Sichuan643000，China；2.Food Science College of Shenyang Agriculture University，Shenyang，Liaoning110161，China）

Four proteases were used in different hydrolysis time and hydrolysis’s antibacterial ability was detected.The results showed：hydrolysis has better inhibition ability ofStaphylococcus aureuswith Flavourzyme in 180 min.Peptides was separated and tested with polyamide column chromatography，ion exchange column chromatography，and gel column chromatography.Molecular weight is about 1 877.67.The minimal inhibitory concentration forEscherichia coliwas 2%.

brewer's spent grains；protease；antimicrobial peptides；antibacterial activity；peptides

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.027

釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（編號(hào)：NJ2010－12）；四 川 理 工 學(xué) 院 科 技 項(xiàng) 目 （編 號(hào)：2010XJKRL002）

宗緒巖（1976－），男，四川理工大學(xué)講師，博士。E－mail：13881410277＠139.com

羅惠波

2011－10－30