于夢(mèng)雪，鄒淑君

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

關(guān)鍵字：緩沖溶液；磷酸鹽；硼酸鹽；Tris-HCl；HEPES

前言

許多實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)際生產(chǎn)以及生物體內(nèi)的生化反應(yīng)等都需要在特定的pH 值范圍內(nèi)才能正常有效地進(jìn)行，從而得出正確的結(jié)果和結(jié)論。在這些反應(yīng)過程中酸堿緩沖溶液經(jīng)常發(fā)揮著非常重要的作用。如人體血漿中存在NaHCO3-H2CO3、蛋白質(zhì)鈉鹽-蛋白質(zhì)、氧合血紅蛋白鉀鹽-氧合血紅蛋白等緩沖對(duì)構(gòu)成血漿的酸堿緩沖系統(tǒng)，以維持正常人血漿的pH 值在7.35～7.45。若血漿pH 值低于7.35 或者高于7.45 則分別會(huì)引起酸中毒和堿中毒，危及生命。因此相關(guān)專業(yè)人員有必要對(duì)緩沖溶液的基本知識(shí)進(jìn)行了解。

1 緩沖溶液概述

酸堿緩沖溶液是指能夠抵抗外加少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿以及水的稀釋作用，并維持溶液pH 值基本不變的溶液。常見的緩沖溶液需具備酸堿緩沖對(duì)，緩沖對(duì)可以是兩種不同的物質(zhì)，如HAc-NaAc 緩沖溶液中的HAc 和NaAc，也可以是一種物質(zhì)里同時(shí)含有互為共軛酸堿的不同基團(tuán)，如鄰苯二甲酸氫鉀中的羧基（-COOH）和羧酸根（-COO-）。當(dāng)然，濃度很大的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿溶液中即使不含有酸堿緩沖對(duì)也有一定的緩沖能力，因?yàn)橥饧由倭康乃峄驂A對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的濃度變化影響很小，所以pH 值基本不變。

緩沖溶液的作用原理是通過互為酸堿緩沖對(duì)之間的酸堿平衡移動(dòng)來抵御外加少量酸、堿以及稀釋作用的。緩沖溶液自身pH 值可根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算[1]，緩沖溶液的緩沖能力可以用緩沖容量進(jìn)行標(biāo)度。但是，任何緩沖溶液的緩沖能力都是有限的，因?yàn)楫?dāng)大量的H+或OH-進(jìn)入溶液時(shí)，緩沖溶液中的緩沖對(duì)將被大量消耗，抗堿、抗酸的作用也隨之減弱直到消失。實(shí)際應(yīng)用中各緩沖對(duì)組成的緩沖溶液都有最佳的緩沖范圍。因此，要用好緩沖溶液，需對(duì)不同的緩沖溶液有具體的了解。以下介紹幾種常見的緩沖溶液及用途，為大家深入理解緩沖溶液提供參考。

2 緩沖溶液實(shí)例

2.1 磷酸鹽緩沖溶液

由于磷酸是三元酸，因此磷酸鹽緩沖溶液的緩沖 對(duì) 可 以 為 H3PO4-H2PO4-、H2PO4--HPO42-或HPO42--PO43-。但生化實(shí)驗(yàn)中常用的磷酸鹽緩沖溶液一般主要由H2PO4--HPO42-的鈉鹽或鉀鹽配制而成。溶液中主要以H2PO4-+H2O?HPO42-+H3O+平衡移動(dòng)體系來維持溶液pH 值的穩(wěn)定，pH 值范圍一般為6.2～8.2。在生化相關(guān)實(shí)驗(yàn)中通常在其中加入NaCl 或者KCl 構(gòu)成磷酸鹽緩沖生理鹽水（簡(jiǎn)稱PBS）來使用。

因磷酸鹽緩沖溶液的pH 值范圍與一些生物活性物質(zhì)存活的酸堿環(huán)境接近，所以在生化實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多，如可用來配置相關(guān)溶液、以及作為組織抗原修復(fù)實(shí)驗(yàn)[2]的修復(fù)液、藥物釋放的溶媒[3,4]等。另外，PBS 作為一種溶劑目前在冷凍保存中也較受歡迎，與其相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究也在不斷的進(jìn)行中[5]。

2.2 硼酸鹽緩沖溶液

硼酸鹽緩沖溶液中的硼酸鹽常見為硼酸鈉，簡(jiǎn)稱硼砂，可以用Na2B4O5（OH）4·8H2O 表示，在水溶液中極易發(fā)生B4O5（OH）4-+5H2O?2H3BO3+2B（OH）4-水解反應(yīng)生成互為緩沖對(duì)的H3BO3和B（OH）4-。常見的硼酸鹽緩沖溶液有硼砂緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液。在構(gòu)成上又有硼酸-硼砂、硼酸-氫氧化鈉、硼砂-氫氧化鈉等多種形式[6]。不同形式構(gòu)成的緩沖溶液會(huì)因物質(zhì)組成以及濃度的不同導(dǎo)致H3BO3和B（OH）4-的來源、濃度及比例不同，從而導(dǎo)致pH值的范圍有所不同。但它們從本質(zhì)上都可歸為通過H3BO3+H2O?B（OH）4-+H+的平衡移動(dòng)來發(fā)揮緩沖作用。

硼砂緩沖溶液的配制是將一定質(zhì)量的硼砂溶于蒸餾水中，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至合適值，pH 值范圍一般為8.0～9.0；也可用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值，pH值范圍一般為8.0～10.8[6]。而硼酸-硼砂緩沖溶液則一般由一定量的硼酸和硼砂溶于蒸餾水中配制而成，pH 值范圍一般為6.5～8.9 左右[6]。當(dāng)應(yīng)用于生化實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要加入一定量的NaCl 以維持溶液等滲。

因硼酸-硼砂緩沖液的pH 值范圍與淚液接近，所以在一些眼藥水的制備中常作為pH 值調(diào)節(jié)劑或滲透壓調(diào)節(jié)劑，如普拉洛芬滴眼液[7]的配制。而硼砂緩沖液則可作為一些藥物的釋放介質(zhì)，如其對(duì)合（氯）霉素有助溶作用。另外，硼酸鹽緩沖液亦可以代替巴比妥緩沖液應(yīng)用于基礎(chǔ)纖維膜電泳教學(xué)實(shí)驗(yàn)中[8,9]。

2.3 三羥甲基氨基甲烷—鹽酸緩沖溶液

三羥甲基氨基甲烷簡(jiǎn)稱Tris，分子式為C4H11NO3，結(jié)構(gòu)式見圖1。分子中的氨基（—NH2）為堿性，因此Tris 是一種弱堿，常與鹽酸構(gòu)成緩沖溶液，簡(jiǎn)稱Tris-HCl 緩沖液。該緩沖液一般由一定質(zhì)量的Tris 溶于蒸餾水中，再用HCl 調(diào)節(jié)至適合的pH 值。在配制時(shí)還需加入NaCl 以維持溶液等滲。因Tris-HCl 緩沖液的pH 值受溶液濃度、溫度影響較大，以及易與空氣中的CO2反應(yīng)，所以在使用時(shí)需現(xiàn)用現(xiàn)配制。

圖1 三羥甲基氨基甲烷的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The constitutional formula of Tris

Tris-HCl 緩沖液的緩沖原理為：Tris 中的-NH2與HCl 結(jié)合生成Tris·HCl 鹽。季銨基團(tuán)Tris·H+與Tris 形成緩沖對(duì)，溶液中存在Tris·H++H2O?Tris+H3O+平衡關(guān)系，憑借該平衡移動(dòng)來發(fā)揮緩沖作用。其緩沖范圍一般為7.0～9.0[10]。

由于Tris 對(duì)生化過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀，所以在DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常應(yīng)用，Tris-HCl 緩沖溶液可以做DNA[11,12]、蛋白質(zhì)[13]的溶解液或提取液，也是DNA 相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)中的重要緩沖液[14,15]，如DNA 的捕獲與釋放[16]、染色體的特異性標(biāo)記[17]等方面。另外，在生物陶瓷材料研究方面，Tris-HCl 緩沖液還可以作為研究過程中一些特定的生物陶瓷體外浸泡液[18]。

2.4 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液

4-羥乙基哌嗪乙磺酸（簡(jiǎn)稱HEPES），分子式為C8H18N2O4S。分子結(jié)構(gòu)中既含有酸性的磺酸基（－SO3H），又含有兩個(gè)堿性叔胺氮，所以呈現(xiàn)兩性，可用來配制兩性離子緩沖液。該緩沖溶液一般由一定相對(duì)分子質(zhì)量的HEPES 溶于蒸餾水中，再用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至適當(dāng)值。其pH 緩沖范圍一般為6.8～8.2[19]。緩沖溶液的濃度以及外界溫度對(duì)其pH值影響不大，因此能夠較長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定的pH 值。

因HEPES 分子中的-SO3H 呈現(xiàn)較強(qiáng)的酸性，易給出H+；兩個(gè)叔胺氮各含有一個(gè)孤對(duì)電子，呈現(xiàn)堿性，可以接受H+生成季銨鹽。所以磺酸基和叔胺在水溶液中互為緩沖對(duì)。而且，單個(gè)HEPES 分子中的叔胺和磺酸基也可傳遞H+生成內(nèi)鹽，即兩性離子。在水溶液中，HEPES 分子、內(nèi)鹽以及磺酸基和叔胺各自產(chǎn)生的離子之間因H+或OH-的轉(zhuǎn)移而能夠相互轉(zhuǎn)化建立平衡關(guān)系，憑借該平衡關(guān)系的移動(dòng)來抵御外來酸堿的影響來調(diào)節(jié)溶液pH 值穩(wěn)定，所以具有緩沖作用，其平衡轉(zhuǎn)化關(guān)系見圖2。

圖2 HEPES 溶液中平衡轉(zhuǎn)化關(guān)系Fig.2 The equilibrium transformation relation in HEPES buffer solution

因HEPES 緩沖溶液具有對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性[20]、不易穿過生物膜、不參與細(xì)胞內(nèi)生化過程等特點(diǎn)，所以在生化實(shí)驗(yàn)中具有廣泛的應(yīng)用，如可用于開放式細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞的長(zhǎng)期觀察、RNA 或DNA 提取試劑盒中。其次，相關(guān)研究表明以HEPES 溶液做緩沖液有利于多肽在金納米粒子表面的偶聯(lián)反應(yīng)[21]。另外，HEPES 緩沖溶液對(duì)鎂生物降解影響[22]的相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，HEPES 能提高鎂的生物降解性以及抑制鎂不溶鹽層的形成。

前述不同緩沖溶液雖然有相似之處，同時(shí)也存在差異，如（1）緩沖溶液應(yīng)用的酸堿度環(huán)境有差異：硼酸鹽緩沖溶液和Tris-HCl 緩沖溶液較適合在堿性環(huán)境中使用，而磷酸鹽緩沖溶液和HEPES 緩沖溶液則多數(shù)情況下適宜運(yùn)用在pH 值為6.8～8.2 左右的弱酸性、弱堿性或接近中性的環(huán)境中；（2）緩沖溶液組成有差異：硼酸鹽緩沖溶液、Tris-HCl 緩沖溶液及磷酸鹽緩沖溶液一般是由兩種物質(zhì)配置而成，而HEPES 緩沖溶液則是由一種物質(zhì)配制；（3）緩沖溶液發(fā)揮緩沖作用的原理有一定差異：硼酸鹽緩沖溶液、Tris-HCl 緩沖溶液及磷酸鹽緩沖溶液靠體系中緩沖對(duì)的電離或水解平衡移動(dòng)來發(fā)揮緩沖作用，而HEPES 緩沖溶液則是靠體系中平衡轉(zhuǎn)化關(guān)系來發(fā)揮緩沖作用；（4）緩沖溶液發(fā)揮作用的側(cè)重方面不同：如同是在生物藥相關(guān)方面的應(yīng)用，磷酸鹽緩沖溶液在固體藥物釋放研究中應(yīng)用較多。而硼砂緩沖溶液多用于液體藥物如滴眼液中。Tris-HCl 緩沖較多用于蛋白質(zhì)、DNA 等生物大分子的實(shí)驗(yàn)研究中。而HEPES 更側(cè)重應(yīng)用于細(xì)胞水平的相關(guān)生化實(shí)驗(yàn)研究中；（5）緩沖溶液在穩(wěn)定性方面各顯利弊：如Tris-HCl 緩沖溶液pH 值受外界影響較大，一般現(xiàn)用現(xiàn)配。同時(shí)需要注意Tris 是一級(jí)脂肪胺，分子結(jié)構(gòu)中的氨基易與醛類化合物發(fā)生縮合反應(yīng)，是一些生化實(shí)驗(yàn)的抑制劑，其次硼酸鹽緩沖液有一定毒性，不宜用做注射液或者口服液的緩沖液。雖然磷酸鹽緩沖溶液穩(wěn)定性很好，但磷酸根具有一定的絡(luò)合能力會(huì)抑制一些與金屬離子有關(guān)的生化反應(yīng)。HEPES 緩沖溶液是較理想的生物緩沖劑，但其有多種生物學(xué)效應(yīng)，如：縮短血液凝固時(shí)間、減緩平滑肌收縮頻率以及阻斷細(xì)胞膜上的陰離子通道等，在一定程度上會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用時(shí)應(yīng)需注意。

3 結(jié)語(yǔ)

體內(nèi)的生化反應(yīng)，醫(yī)學(xué)檢測(cè)，藥物生產(chǎn)與保存以及分析實(shí)驗(yàn)等都常需緩沖溶液的參與才能正常進(jìn)行，同時(shí)所需要的緩沖液又各有不同。因此對(duì)于理、農(nóng)、林、醫(yī)、食品、衛(wèi)生等相關(guān)專業(yè)的學(xué)生來說，只有掌握緩沖溶液的相關(guān)知識(shí)及用途，才能正確地根據(jù)實(shí)際需要選擇一定濃度和pH 值的緩沖溶液來使用。在選擇緩沖溶液時(shí)，既要考慮它的毒性、穩(wěn)定性、有效的緩沖范圍，還要考慮所選緩沖溶液是否與主體物質(zhì)反應(yīng)、對(duì)主體物質(zhì)的干擾性以及是否與主藥發(fā)生配伍禁忌等。目前，已知的緩沖溶液種類很多，許多緩沖溶液的配制方法都可在化驗(yàn)室化學(xué)分析實(shí)用手冊(cè)等現(xiàn)成手冊(cè)中查到。相信隨著科學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)的不斷豐富和發(fā)展，越來越多的緩沖溶液會(huì)被開發(fā)運(yùn)用并發(fā)揮重要作用。