劉 果，謝耀堅(jiān)，張黨權(quán) ，谷振軍

（1.國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022；2.中南林業(yè)科技大學(xué)；a.林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

基于基因組DNA混合池的EST-SSR引物快速篩選方法研究

劉 果1，謝耀堅(jiān)1，張黨權(quán)2，谷振軍2

（1.國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022；2.中南林業(yè)科技大學(xué)；a.林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

林木SSR標(biāo)記的引物篩選工作量大，十分費(fèi)時(shí)且消耗大量實(shí)驗(yàn)材料。采用基因組DNA混合池技術(shù)，將研究對象的若干個(gè)基因組DNA樣品等量混合后，作為單一模板進(jìn)行SSR的PCR擴(kuò)增，能顯著降低實(shí)驗(yàn)的工作量和成本。以選擇的150對EST-SSR引物為對象，對6個(gè)桉樹基因組DNA樣品進(jìn)行等量混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選引物，結(jié)果表明，與常規(guī)篩選方法相比，基因組DNA混合池方法大幅度縮短了實(shí)驗(yàn)周期，顯著減少了基因組DNA的消耗，可用于大量林木SSR引物的快速高效篩選。

基因組DNA混合池；引物篩選；EST-SSR，PCR

簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats, SSR)又稱微衛(wèi)星序列，廣泛分布于整個(gè)基因組。SSR作為DNA遺傳標(biāo)記具有高度變異性、共顯性、重復(fù)性好、基因組覆蓋率高等優(yōu)異特性而被廣泛應(yīng)用[1-4]。近些年，利用大量公共ESTs數(shù)據(jù)庫來開發(fā)EST-SSR標(biāo)記已成為一種非常有效的途徑。與傳統(tǒng)SSR標(biāo)記開發(fā)相比，基于數(shù)據(jù)庫的EST-SSR標(biāo)記開發(fā)無需構(gòu)建基因組文庫或EST文庫，也無需再進(jìn)行克隆測序，而且還充分利用了現(xiàn)有的數(shù)據(jù)資源，極大地降低了開發(fā)成本。EST-SSR來自于基因組的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，因此表現(xiàn)的更為保守為，在其他相近物種中通用性更好[5-7]，且與很多重要的功能位點(diǎn)連鎖不平衡[8]。在大多數(shù)群體的遺傳分析中表明，EST-SSR標(biāo)記能很好的揭示高水平的遺傳變異[7-11]。EST-SSR標(biāo)記在構(gòu)建遺傳圖譜、群體遺傳多樣性、進(jìn)化遺傳學(xué)已經(jīng)種質(zhì)資源收集等方面有很大的研究潛力。

桉樹是世界上著名的經(jīng)營利用樹種之一，由于其生長速度快、輪伐期短、耐干旱、耐瘦瘠、適應(yīng)性廣，且用途廣泛，經(jīng)濟(jì)效益高，現(xiàn)已被世界近百個(gè)國家與地區(qū)引種，遍布于中南海地區(qū)、東南亞、美洲和非洲，目前已經(jīng)成為世界人工林的第二大類造林樹種[12-13]。在桉屬植物中SSR標(biāo)記有高度的保守性和遺傳多樣性，所以對桉樹進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，非常有利于對桉樹遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性與分子標(biāo)記輔助選擇育種研究[14]。截至2012年5月，在公共數(shù)據(jù)庫NCBI中已有16萬多條桉樹的EST序列，采用傳統(tǒng)篩選方法進(jìn)行大量SSR引物開發(fā)耗時(shí)費(fèi)力。近年來在國際上逐漸被廣泛應(yīng)用的DNA混合池技術(shù)[15]能有效解決這個(gè)問題，可以最大限度的減少研究人員的工作量和試劑成本，使得大量引物的開發(fā)工作成為可能。DNA混合池技術(shù)是把多個(gè)樣本的DNA溶液混合在一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增、基因掃描、基因分型、最后用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[16]。對組成混合池的樣本數(shù)量沒有固定的要求，少到幾個(gè)、多到幾千個(gè)樣本都可以組成DNA混合池[17-18]。 DNA混合池技術(shù)近年來在國際上已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上各種疾病的研究，但應(yīng)用于植物上的研究還甚少。本研究采用基因組DNA混合池技術(shù)，通過構(gòu)建6個(gè)桉樹樣品的基因組DNA混合池快速篩選EST-SSR標(biāo)記，并與常規(guī)方法篩選方法進(jìn)行驗(yàn)證，為林木SSR引物的大量開發(fā)提供一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

設(shè)計(jì)的引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司公司合成。本實(shí)驗(yàn)所用桉樹葉片采集于國家南方重要種苗基地和廣東省雷州林業(yè)局，其中細(xì)葉桉（1號）、巨桉（2號）和粗皮桉（6號）采集于廣東省遂溪縣南方國家級重要種苗基地，尾葉桉（3號）、赤桉（4號）和檸檬桉（5號）采集于廣東省雷州市。

1.2 ET-SSR標(biāo)記的引物選擇

1.2.1 EST數(shù)據(jù)的獲得和預(yù)處理

從美國NCBI公共數(shù)據(jù)庫dbEST提供的桉樹EST序列中下載了2010年和2011年更新（截至2011.11.7）的EST序列共16566條，其中巨桉16008條，藍(lán)桉558條。

在開發(fā)之前需要對下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括去除一些低質(zhì)量的片段（＜100 bp）和帶有少量載體序列及末端存在polyA/T“尾巴”的序列。這些數(shù)據(jù)會影響相關(guān)信息的分析。只有無冗余的EST數(shù)據(jù)庫的SSR頻率才能更真實(shí)的反應(yīng)SSR在基因組轉(zhuǎn)錄部分的密度。本實(shí)驗(yàn)利用DNAStar軟件下的SeqManⅡ操作系統(tǒng)對所有下載的序列分別樹種進(jìn)行去冗拼接和聚類。

1.2.2 EST-SSR位點(diǎn)的查找及引物的設(shè)計(jì)和評估

利用SSRHunter軟件對Contigs序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)查找。查找標(biāo)準(zhǔn)為含有2,3,4,5,6堿基重復(fù)的SSR位點(diǎn)，其重復(fù)次數(shù)分別不小于9,6,5,4,3，即堿基重復(fù)至少要達(dá)到18個(gè)堿基長度。

對所有篩選出的含有SSR位點(diǎn)的Contigs序列利用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)遵循3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)；其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)； 再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（即錯(cuò)配)。最后利用Oligo6.0軟件對所設(shè)計(jì)出的引物進(jìn)行評價(jià)分析并篩選出評價(jià)高的引物，評價(jià)分析的標(biāo)準(zhǔn)為：1) ΔG值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的ΔG值在5′端和中間值比較高，而在3′端相對低。2) Tm值曲線以選取72℃附近為佳，5′到3′的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。3) Frq曲線揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用3′端Frq值相對較低的片段。

1.3 基因組DNA提取與混合池構(gòu)建

桉樹葉片樣品的DNA提取采用QIAGEN公司的植物DNA基因組提取試劑盒（DNeasy Plant Mini kit）。 取 DNA 樣 品 3.0 μL 與 1.0 μL 6×Loading Buffer混勻后用1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測DNA樣品濃度，檢測染料為GelRedTM(100ml瓊脂糖凝膠加3μL)，用100 bp DNA ladder標(biāo)定，初步判斷2μL中含有DNA的量，然后根據(jù)檢測結(jié)果稀釋DNA，以供后續(xù)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)用，并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

將6個(gè)桉樹基因組DNA樣品等量混合，構(gòu)建一個(gè)基因組DNA混合池，取混合池樣品3.0 μL與1.0 μL 6×Loading Buffer混勻后用1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測其濃度，根據(jù)DNA樣品濃度稀釋混合池樣品，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)利用。

1.4 EST-SSR引物的篩選

1.4.1 SSR-PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化及引物快速篩選

以各樣品的基因組濃度一致的基因組DNA混合池為模板進(jìn)，擴(kuò)增體系參照李發(fā)根[19]設(shè)計(jì)的SSR引物篩選程序進(jìn)行PCR優(yōu)化和擴(kuò)增。通過調(diào)整EST-SSR引物的Mg2+濃度和退火溫度（Tm）來進(jìn)行PCR優(yōu)化，使擴(kuò)增產(chǎn)物具有較好的特異性及較高的濃度。20 μL的PCR反應(yīng)體系中，Mg2+濃度設(shè)置為1.5、2.0、2.5 mmol 3個(gè)梯度，退火溫度（Tm）設(shè)置為50、56、60℃ 3個(gè)梯度。先將所有引物在Mg2+濃度為2.5 mmol、Tm為56℃條件下進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測和凝膠成像觀察，擴(kuò)增結(jié)果為明顯的單一條帶或兩條條帶，其中亮帶較弱帶強(qiáng)2倍以上的引物保留。再將剩下的引物繼續(xù)在Mg2+濃度為2.0 mmol或1.5 mmol條件下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，保留結(jié)果較好的引物。最后改變Tm溫度為50℃或60℃條件，并與三種Mg2+濃度相互交叉，反復(fù)篩選，每一輪篩選保留擴(kuò)增結(jié)果較好的引物，篩選到最后仍然得不到較理想擴(kuò)增產(chǎn)物的引物舍棄。具體的PCR擴(kuò)增體系如表一所示。

表1 20 μL PCR反應(yīng)體系Table 120μL PCR reaction system

PCR擴(kuò)增循環(huán)條件是： 94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，Tm退火（56℃、50℃、60℃）30s，72℃延伸1min（35個(gè)循環(huán)）；?72℃后延伸10 min。

2.4.2 常規(guī)EST-SSR引物篩選與快速篩選的對比分析

常規(guī)引物篩選是對代表性的基因組DNA樣品（6個(gè)）進(jìn)行篩選驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)安排了在快速篩選實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選出3對擴(kuò)增結(jié)果好的引物（eSSR-GR029、eSSR-GR035、eSSR-GR074）進(jìn)行常規(guī)PCR技術(shù)篩選驗(yàn)證；同時(shí)，在快速篩選實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選出3對擴(kuò)增結(jié)果不好的引物（eSSR-GL001、eSSR-GR010、eSSR-GR117）進(jìn)行常規(guī)PCR篩選驗(yàn)證。擴(kuò)增體系及循環(huán)條件與快速篩選實(shí)驗(yàn)相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA樣品濃度的檢測

由QIAGEN公司的基因組提取試劑盒（DNeasy Plant Mini kit）提取的桉葉DNA質(zhì)量較好，沒有條帶拖尾和雜帶的現(xiàn)象。圖1為6個(gè)桉樹DNA樣品和DNA混合池樣品的電泳檢測圖，點(diǎn)樣為 3.0 μL 與 1.0 μL 6 × loading buffer的混合。由圖可得到，1、2、3號桉樹DNA樣品的濃度比較一致，4、5、6號桉樹DNA樣品的濃度比較一致。按照基因組DNA樣品終濃度10 ng/μL，將1、2、3號樣品稀釋一倍后與4、5、6號樣品等量混合，待用。

圖1 桉葉基因組DNA提取電泳效果Fig. 1Eucalyptus genomic DNA detected by electrophoresis

2.2 EST-SSR引物設(shè)計(jì)

經(jīng)軟件分析含有SSR位點(diǎn)的可以用來設(shè)計(jì)引物的EST-Contigs序列一共有820條，其中藍(lán)桉的序列有24條，巨桉的序列有796條。隨機(jī)挑選部分設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)EST-SSR引物150對用于本次實(shí)驗(yàn)，其中由藍(lán)桉的EST序列設(shè)計(jì)的引物有9對，由巨桉的EST序列設(shè)計(jì)的引物有141對。EST-SSR引物長度均為18～22bp，引物設(shè)計(jì)的目的片段大小均為200～500 bp。

2.3 EST-SSR引物快速篩選的PCR體系優(yōu)化

經(jīng) PCR 擴(kuò)增后，取其產(chǎn)物 3.0 μL 與 1.0 μL 6× Loading Buffer混合用來電泳檢測，選取擴(kuò)增出明亮單一或者有兩條條帶，其中亮帶比弱帶強(qiáng)2倍以上的片段的引物，該引物可以直接用來后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其余雜帶較多，條帶比較模糊的引物或者無條帶的引物都要進(jìn)行Mg2+濃度和Tm退火溫度的優(yōu)化。如圖2，其中豎箭頭指出的是較好的條帶，橫箭頭指的是100 bp DNA Ladder。

圖2 部分EST-SSR引物快速篩選Fig. 2Fast screening result of partial EST-SSR primers

3.4 EST-SSR引物快速篩選分析

9輪PCR體系優(yōu)化的篩選后，成功擴(kuò)增的引物有136對，獲得比較單一明亮的片段，擴(kuò)增成功率達(dá)90.667%。說明了藍(lán)桉和巨桉的EST序列在桉樹種中的通用性較好。從表1中可以得到，第一輪篩選（2.5 mmol和56℃）和第二輪篩選（2.0 mmol和56℃），基本成功擴(kuò)增的就達(dá)到了70.667%，與李發(fā)根[19]和郭勇[20]中的引物篩選結(jié)果相一致，其余擴(kuò)增效果不好的進(jìn)入下一輪的篩選。

表1 EST-SSR引物篩選結(jié)果Table 1The results of EST-SSR primer screening

圖3 eSSR-GR029、eSSR-GR035、eSSR-GR074三對引物單一樣本擴(kuò)增效果Fig.3Three pairs primers (eSSR-GR029, eSSR-GR035, eSSR-GR074) single template PCR detected by electrophoresis

圖4 eSSR-GL001、eSSR-GR010、eSSR-GR106引物單一樣品擴(kuò)增效果Fig.4 Primers(eSSR-GL001, eSSR-GR010, eSSR-GR106)single sample PCR detected by electrophoresis

2.5 引物常規(guī)篩選與快速篩選的比較分析

在與快速篩選相同體系和循環(huán)條件下，進(jìn)行了6對引物的常規(guī)篩選驗(yàn)證，3對為快速篩選結(jié)果較優(yōu)的引物，其余3對為快速篩選中結(jié)果較差的引物。如圖3分別為eSSR-GR029、eSSR-GR035、eSSR-GR074用6個(gè)DNA樣品PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物檢測圖。圖中，第一個(gè)白色箭頭指的是3(a)為引物eSSR-GR029的單一樣品逐一擴(kuò)增圖，引物在1、2、3、4、6號樣品中擴(kuò)增效果都比較好，在DNA混合樣品中也有很好的擴(kuò)增效果，但5號樣品的擴(kuò)增效果不佳；3(b)為引物eSSR-GR035的單一樣品逐一擴(kuò)增圖，引物在6個(gè)樣品中的擴(kuò)增效果都比較好；3(c)位引物eSSR-GR074的單一樣品逐一擴(kuò)增圖，引物在1、2、3、6號和DNA混合樣品中都有很好的效果，但4號和5號樣品基本檢測不到條帶。圖4為 eSSR-GL005、eSSR-GR010、eSSR-GR106用6個(gè)DNA單一樣品和DNA混合池逐一PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物檢測圖，其中，白色箭頭指的是DNA混合池樣本PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物。由圖可看出，三對引物的擴(kuò)增效果在單一樣本和DNA混合池中均不理想，都沒有出現(xiàn)明顯的單一條帶，得到的條帶模糊不清晰，兩種方法得到的結(jié)果一致，eSSR-GL005、eSSR-GR010、eSSR-GR106不是理想的引物。

3 結(jié)論與討論

本研究基于基因組DNA混合池技術(shù)，建立了一種適用于EST-SSR標(biāo)記特異性引物的快速高效篩選方法，適用率達(dá)到83.33%，工作量比常規(guī)單樣本逐一篩選引物方法降低了約80%。

（1）基因組DNA混合池的構(gòu)建。本實(shí)驗(yàn)中基因組DNA混合池是選用的6個(gè)桉樹基因組DNA樣品進(jìn)行等量混合，保證了各個(gè)樣品在混合池中的濃度和數(shù)量，使得構(gòu)建出來的DNA混合池能夠相等的代表其中的6個(gè)樣品。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的濃度也充分顯示出構(gòu)建的DNA混合池與六個(gè)樣品的濃度和片段大小都比較一致，可以作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選引物。

（2）基因組DNA混合池的引物快速篩選的可靠性。本實(shí)驗(yàn)中采用的是6種常見桉樹的DNA樣品作為模板進(jìn)行混合構(gòu)建的DNA混合池，并以混合池為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板進(jìn)行EST-SSR引物的篩選。從篩選結(jié)果可以得出，DNA混合池模板PCR擴(kuò)增的條帶清晰明亮，與各樣品分開PCR擴(kuò)增得到的條帶，片段大小和條帶清晰度一致。在常規(guī)篩選實(shí)驗(yàn)中，三對較好引物的條帶在1號（細(xì)葉桉），2號（巨桉）,3號（尾葉桉），6號（粗皮桉）四種桉樹中條帶均單一明亮，通用性很好。4號（赤桉）在eSSR-GR074中沒有條帶出現(xiàn)，5號（檸檬桉）在eSSR-GR029和eSSR-GR074兩對引物中都沒有條帶出現(xiàn)，適用率達(dá)到83.33%。

（3）基于基因組DNA混合池的EST-SSR引物快速篩選方法的效率及適應(yīng)性。本方法的研究基礎(chǔ)是基于基因組DNA混合池技術(shù)與簡單重復(fù)序列（SSR）研究的相結(jié)合[14,18-19]。由于SSR標(biāo)記技術(shù)屬于特異性引物的分子標(biāo)記技術(shù)[20]，對DNA模板的要求不是很高，而且結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好[21-27]，利用基因組DNA混合池代替各個(gè)樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)，滿足SSR標(biāo)記技術(shù)對DNA模板的要求。因此，具有特異性引物的分子標(biāo)記技術(shù)，使用DNA混合池可以進(jìn)行引物的快速篩選。

常規(guī)SSR引物的篩選，為保障有效性需對至少5個(gè)樣本逐一進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對于大量的引物設(shè)計(jì)，工作量非常大，且消耗大量基因組DNA樣品。使用DNA混合池對大量引物進(jìn)行篩選，工作量僅為原來工作量的約五分之一，能切實(shí)有效的提高工作效率，顯著降低基因組DNA消耗和實(shí)驗(yàn)成本。

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Studies on quick screening of EST-SSR primers based on genomic DNA mixing pool

LIU Guo1, XIE Yao-jian1, ZHANG Dang-quan2, GU Zheng-jun2
(1.China Eucalypt Research Centre, Zhanjiang 524022, Guangdong, China; 2.a. Hunan Provincial Key laboratory of Forestry biotechnology; 2b. Key Laboratory of Non-wood Forest Products of State Forestry Ministry; 2c. Key Laboratory of Non-wood Forest trees and protection of Ministry of Education, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

The screening of SSR primers for forestry is a heavy research which is very time consuming and consume intensive experimental materials. By employing genomic DNA pooling technology, a method of mixing several genomic DNA templates equivalently as the single template for PCR, was used to quickly screen SSR primers, which will signif i cantly reduce the experimental workload and cost. Genomic DNA pooling constructed by equivalently mixing 6 Eucalyptus genomic DNA templates was used to screen 150 pairs of EST-SSR primers. The analytical results show that comparing with conventional screening method, the genomic DNA pooling method can greatly shorten experimental period and signif i cantly reduce the consumption of genomic DNA, suggesting that this method is a fast and eff i cient method for screening substantive SSR primers used in trees.

genomic DNA mixing pool; primer screening; EST-SSR; PCR

S792.39

A

1673-923X(2012)09-0124-06

2012-08-15

林業(yè)公益性行業(yè)專項(xiàng)（201104003）；863課題（2011AA100202）；湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2010NK2008，2011NK2019）；國家863計(jì)劃課題（2011AA100203）

劉 果(1988-)，女，碩士生，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種；Email：liuguopz@163.com

謝耀堅(jiān)，男，博士，研究員，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種；Email：Xieyj@21cn.com

[本文編校：歐陽欽]