陳圣林 ，王會娜 ，孫 穎 ，陳 顯 ，李建安

(1.中國林業(yè)產(chǎn)業(yè)聯(lián)合會，北京 100714；2.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004)

三峽庫區(qū)14個李品種遺傳多樣性的ISSR分析

陳圣林1，王會娜2，孫 穎2，陳 顯2，李建安2

(1.中國林業(yè)產(chǎn)業(yè)聯(lián)合會，北京 100714；2.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004)

以湖北省秭歸縣三峽庫區(qū)的14個李品種為研究材料，根據(jù)優(yōu)化的ISSR-PCR反應體系，從24條引物中篩選出10條擴增條帶特異性好、條帶數(shù)目適中、條帶清晰、重復性好的引物，總共擴增出101條清晰可重復的DNA條帶，其中83條為多態(tài)性條帶，多態(tài)帶百分率為82.18%，每個引物擴增的條帶大小在300～3000 bp之間，數(shù)目在8～12條之間，平均為10.1條。應用軟件POPGENE 1.31和NTSYS-pc對所得數(shù)據(jù)進行分析處理，從而得出14個李品種的遺傳相似系數(shù)和遺傳遺傳距離，并繪制出品種相似性的UPGMA聚類圖和主坐標分析的二維、三維散點圖，結果表明:遺傳一致度的變化范圍在0.6022～0.8636之間，遺傳距離的變化范圍在0.146 7～0.507 2之間。根據(jù)品種相似性的聚類圖和主坐標分析圖，可將14個李品種分為3大類:美國布朗李系列品種、中國李系列品種以及介于兩者之間的雜合種，其中雜合種與中國李系列品種的遺傳相似性更高。

李；遺傳多樣性；遺傳距離；ISSR；PCR

李樹屬薔薇科Rosaceae李屬PrunusL植物，該屬大約有30余個種或變種[1]。李按其起源中心可分為3個系：①東亞系，主要有中國李、烏蘇里李、杏李等；②歐亞系，主要有歐洲李、櫻桃李、黑刺李、烏荊子李；③北美系，主要有美洲李、加拿大李、果醬李、天鵝李、狹葉李、亞心形李或太平洋李。李是我國栽培歷史悠久的果樹樹種。據(jù)考古學研究證明，遠在5 000乃至6 000年前，我國的祖先己經(jīng)采食李的果實，用以充饑，有記載的栽培歷史在3500年以上[2]。到目前為止，我國李由8個種5個變種800余個品種及類型，①中國李，其變種有毛梗李、柰李；②杏李；③烏蘇里李；④櫻桃李，其變種有紫葉李；⑤歐洲李；⑥美洲李；⑦黑刺李；⑧加拿大李[3]。

李樹樹種之間容易雜交培育出超過親本的雜交種，并容易培育出優(yōu)良無性系進行無性繁殖，特別是從20世紀60年代開始，我國引進了很多國外李品種，在選出適宜的品種后，進行種源和家系的篩選，然后選出優(yōu)良單株進行無性繁殖，同時對不同種的優(yōu)良單株進行雜交育種，選出超出親本的優(yōu)良雜交種進行栽植推廣，造成我國現(xiàn)有李品種種源關系較為混亂，品種良莠不齊，不利于我國李產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因而，有必要對我國的李樹品種間進行分子水平上的遺傳多樣性分析，為建立李樹種植資源庫打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

該實驗材料來自湖北省秭歸縣三峽庫區(qū)的14個李品種（見表1），于2009年10月采集各品種的新葉帶回實驗室，并保存與-70 ℃冰箱中備用。

1.2 引物序列及合成

該研究所用的引物為參照有關文獻[4-7]，從哥倫比亞大學(UBC)設計的100條引物中篩選出24條引物序列，由上海博尚生物技術有限公司合成。

1.3 李樹基因組DNA的提取

該實驗采用試劑盒法提取李樹葉片中的基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用核酸蛋白質分析儀測定OD260和OD280的值[8]，計算其濃度。

1.4 ISSR-PCR體系及引物的篩選

采用優(yōu)化的ISSR-PCR反應體系為:20 μL的反應體系中，10×Buffer(Mg2+free)2.0 μL，1.5 U Tap DNA 聚合酶，0.5 μmol/L 的引物，0.2mmol/L的dNTPs，20 ng 模板DNA。最佳PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94℃變性45 s；56℃退火1min；72℃延伸10 min；39個循環(huán)，72℃延伸10 min，最后16 ℃保存10 min。

利用該體系，隨即篩選出3個種源在24條引物中篩選出適合14個李品種ISSR-PCR擴增、擴增條帶清晰且多態(tài)性好的引物，然后再分別用不同的引物對14個李品種的基因組DNA進行全面擴增，每個引物重復3次，以保證實驗結果的可靠性。

2 結果與分析

2.1 李樹基因組DNA的提取及質量檢測

采用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取14個李品種的基因組DNA，通過純化后最終用TE緩沖液定容至100 μL，并用0.8瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖1)。結果表明，所提取的DNA條帶清晰，無明顯的拖帶現(xiàn)象，提取效果較好。通過核酸蛋白分析儀測定分析，所提取的基因組DNA的純度R(OD260/OD280)值在1.7～1.8之間，表明所提樣品中RNA與蛋白質的含量較少，可以滿足PCR擴增的要求。

表1 李樹14個品種名稱及樣品編號Table 1Number and name of 14 Prunus

圖1 李樹14個樣品的基因組DNA電泳圖像Fig.1Electrophoresis pattern of genomic DNA from 14 species of Prunus

2.2 李樹ISSR-PCR擴增結果

利用已經(jīng)優(yōu)化的李樹ISSR-PCR反應體系，對24條引物進行篩選，獲得10條適合14個李品種的ISSR擴增反應的引物(見表2)，該10條引物的擴增條帶特異、條帶數(shù)適中、清晰、可重復性好(見圖2)。

表2 李樹14個樣品的ISSR擴增引物及獲得的條帶數(shù)Table 2Primers used for ISSR-PCR on 14 Prunus samples and band numbers of per primer

圖2 引物UBC 857對李樹14個樣品的ISSR-PCR擴增電泳圖像Fig.2PCR result of 14 Prunus samples by ISSR

10條引物對全部14個李品種擴增，共擴增出101條清晰且可重復的DNA條帶，其中有83條屬多態(tài)帶，每個引物所擴增出來的DNA條帶數(shù)目不等，在8～13條之間，平均為10.1條，總多態(tài)百分率為82.18%，其中引物UBC866擴增的多態(tài)帶百分率最高，為100%(見表2)。10條引物所擴增的DNA片段的大小范圍在300～3000 bp，完全符合分子標記對擴增條帶的要求。

2.3 李樹的遺傳距離與遺傳一致度的分析

遺傳距離（genetic distance）和遺傳一致度（genetic identity）是用來衡量兩個物種之間遺傳分化程度的重要指標。本實驗采用Nei’s遺傳距離和遺傳一致度，并應用POPGENE 1.31分析軟件對14個李品種進行分析（見表3）。表2表明，14個李品種中，遺傳距離的變化范圍在0.146 7～0.507 2之間，遺傳一致度的變化范圍在0.6022～0.860 1之間。青皮麥李和紅皮麥李遺傳距離最小，為0.146 7，同時相應的遺傳一致度最高，為0.8636；空心李和紅皮麥李具有最大的遺傳距離，為0.507 2，相應的其遺傳一致度也最低，為0.6022。

2.4 李樹14個品種的親緣關系聚類分析

本實驗應用NTSYS-pc軟件對14個李品種進行UPGMA聚類分析(見圖3)[9]。圖3表明，14個李品種之間的親緣關系為:秭秋、秭露、秋露、梅李女皇之間的親緣關系較近，可聚為一組；變異株、黒霸、空心李、谷李、紫琥珀、早美麗、青皮麥李、大紅玫瑰、艷紅、紅皮麥李之間的親緣關系較近，聚為第二組。第二組中變異株和黒霸的親緣關系較近，空心李、谷李、早美麗、大紅玫瑰、艷紅之間的親緣關系較近，青皮麥李和紅皮麥李之間的親緣關系較近，紫琥珀與其他品種親緣關系均較遠。11和14兩個品種間的遺傳相似性最近，既表明其親緣關系最近，與POPGENE 1.31軟件進行分析是結果一致。

表3 李樹14個品種間的遺傳一致度(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)Table 3Nei’s original measures of genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)among 14 samples of Prunus

圖3 李樹14樣品相似性的UPGMA聚類圖像Fig.3UPGMA dendrogram of genetic similarity among 14 samples of Prunus

2.5 李樹14個品種遺傳分化的主坐標分析

主坐標分析（Principal Coordinates Analysis）以品種間的相似性系數(shù)矩陣為基礎，建立新的坐標系，不同品種在主坐標圖中的位置能反映出它們之間的親緣關系。品種間位置越接近，表明它們的遺傳相似性越大，親緣關系越近，反之，則表明其遺傳差異越大，親緣關系越遠[9]。本實驗在聚類分析的基礎上，應用NTSYS-pc軟件對14個李品種進行主坐標分析，分別建立14個李品種的主坐標二維散點圖（見圖4）和主坐標三維散點圖（見圖5）。

圖4 李品種資源主坐標分析二維散點圖像Fig.4 Two-dimensions scatter-graph of Prunus species by principal coordinate analysis

圖5 李品種資源主坐標分析三維散點圖像Fig.5 Three-dimensions scatter-graph of Prunus species by principal coordinate analysis

從主坐標二維散點圖和三維散點圖可以看出，秭秋、秭露、秋露、梅李女皇親緣關系較近，可聚為一類；其它可聚為第二類，其中青皮麥李和紅皮麥李親緣關系最近，與POPGENG軟件分析得出的遺傳距離與遺傳一致度關系基本一致。

3 結論與討論

采用優(yōu)化的ISSR-PCR反應體系，對李樹的14個品種進行了擴增，從24條引物中挑選出10條重復性好、條帶特異、多態(tài)性明顯且條帶清晰的引物。該10條引物對對14個品種分別擴增出101條清晰可重復的DNA條帶，其中有83條屬于多態(tài)帶，平均每條引物為8.3條多態(tài)帶，各引物的多態(tài)百分率在63.6%～100%之間，平均為82.18%，其中擴增條帶長度在300～3000 bp之間。通過POPGENE 1.31軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析得出，14個李品種的Nei’s遺傳距離的變化范圍在0.146 7～0.507 2之間，遺傳一致度的變化范圍在0.6022～0.860 1之間。

利用NTSYS-pc軟件對14個李品種進行分析，得出14個品種的相似性UPGAM聚類圖和主坐標分析二維、三維散點圖，結果表明：14個品種中秭秋、秭露、秋露、梅李女皇4個李品種與其余10個李品種間遺傳分化較為明顯，遺傳多樣性較高，而該4個李品種間相似性較高，遺傳分化程度相對較小。該4個品種中秭秋、秭露、秋露是由布朗李系列品種中的佛萊索、秋姬、安哥諾引種馴化而來，而梅李女皇亦是由60年代由美國引進的布朗李系列品種。紅皮麥李、青皮麥李、空心李、谷李、紅心李、密斯、黑霸、紫琥珀、早美麗、大紅玫瑰10個品種遺傳相似性較高，其中紅皮麥李、青皮麥李、空心李、谷李、紅心李為中國李品種，密斯李未中國李與櫻桃李的雜交種，紫琥珀、早美麗、大紅玫瑰為中國李與美國李的雜交種，其中雜交種的親緣關系與中國李更為接近，同時反映出李不同種源間具有較高的遺傳多樣性水平，這與其分布范圍廣泛有關。

ISSR分 子 標 記 技 術 與ALFP、RLFE、RAPD、SSR等分子標記技術相比，具有可重復性高、多態(tài)性位點豐富、技術難度低、操作性強等優(yōu)點，因而被廣泛應用于品種間的遺傳多樣性分析、品種鑒定等分子研究方面的分子標記技術，然而，實驗中發(fā)現(xiàn)ISSR分子標記技術也存在一些問題，例如Tap酶濃度、Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度等條件對ISSR-PCR的影響較大，條件不適宜可能造成非特異性條帶較多、拖帶嚴重等現(xiàn)象[10-11]。同時部分條帶較弱，在進行遺傳多樣性分析時，這些弱帶是否被統(tǒng)計在內，沒有一定的標準，主觀性較強，這就使遺傳多樣性分析、遺傳圖譜建立和品種鑒定等結果出現(xiàn)不穩(wěn)定性， 這些弱帶的原因可能是由于存在其他一些較亮的條帶，從而抑制了這些弱帶的擴增或隨機引物在此結合位點的結合率較低等[12]。因此，針對這些問題，我們還需要在以后的試驗中繼續(xù)探討，以促進ISSR分子標記技術的成熟。

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ISSR analysis on genetic diversity of fourteen Prunus varieties in three gorges reservoir area

CHEN Sheng-lin1,WANG Hui-na2,SUN Ying2,CHEN Xian2,LIJian-an2
(1.Chinese Forestry Industry Association, Beijing 100714, China; 2.Central South University of Technology & Forestry, Changsha 410004, Hunan, China)

The 14Prunussamples from Zigui county, Hubei province, were used as the materials to analyze their genetic diversity.According to the improved ISSR-PCR reaction system and amplification condition, 10 primers were selected out from 24 random primers which can yield specific bands with moderate band numbers, clear background and well reproducibility. Total 101specific and reproducible DNA bands were obtained of which 83are polymorphic bands which polymorphism were 82.18%. Each primer can yield bands spanning 300～3000 bp and band number varies from 8 to 12(average 10.1). Biosofteares including POPGENE 1.31and NTSYS-pc were used to analyze the polymorphic bands obtained, and hence to yield the genetic similarity coeff i cient of the 14 samples and map the related graphics. The results show that the genetic identity varies between 0.6033～0.860 8, and the genetic distance varies between 0.146 7～0.507 2, and that the 14 samples ofPrunuscan be divided into three groups: the fi rst wasPrunus AmericanaMarsh,second wasPrunus salicina, the three was coeno-species. The higher genetic similarity was between coeno-species andPrunus salicina.

Prunus; genetic identity; genetic distance; ISSR; PCR

S794.4；S718.46

A

1673-923X(2012)09-0130-05

2012-08-15

林業(yè)公益行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201104052);國務院三峽辦移民科研項目(鄂移[2009]185)

陳圣林(1968-)，男，湖北天門人，工程師，博士，主要從事經(jīng)濟林栽培育種與產(chǎn)業(yè)開發(fā)工作

[本文編校:吳 毅]