化妝品中存在許多光感性物質(zhì),如含有共軛結(jié)構(gòu)的防曬劑、指甲油和唇膏的某些著色劑、用于化妝品中的殺菌劑三氧N-碳酸苯胺、三氯生,含香豆素類(lèi)的某些植物提取物(如甘菊環(huán)烴、六-甲基香豆素、貫葉金絲桃提取物、茉莉、肉桂、葵子麝香),以及藥物和某些功能性化妝品(特殊用途化妝品)原料如氯丙嗪、鹽酸氯丙嗪氟喹諾酮、噻嗪、酚噻嗪、磺胺、喹啉、苯酮等。這些物質(zhì)通過(guò)接觸、口服、注射等途徑進(jìn)入體內(nèi),與一定照射劑量的光線或紫外線接觸后誘發(fā)的不良反應(yīng)均可稱(chēng)之為光毒性效應(yīng),具體可包括皮膚毒性反應(yīng)、遲發(fā)性免疫反應(yīng)、光遺傳毒性和光致癌性等。
各國(guó)化妝品法規(guī)均規(guī)定,能吸收紫外線的化妝品成分和化妝品成分的混合物(用于紫外線過(guò)濾劑的化學(xué)物,例如用于確?;瘖y品的光穩(wěn)定性或用于防曬產(chǎn)品中)應(yīng)進(jìn)行急性光毒性和潛在光遺傳毒性測(cè)試。對(duì)于潛在光致敏性和光遺傳毒性的測(cè)試不作特別要求,但這類(lèi)試驗(yàn)也常進(jìn)行。
一、光毒性效應(yīng)及臨床表現(xiàn) 紫外線是由原子的最外層電子從高能級(jí)向低能級(jí)躍遷時(shí)以光形式釋放的能量,根據(jù)波長(zhǎng)范圍分為UVA(315nm~400nm)、UVB(280nm~315nm)和UVC?(100nm~280nm),不同波長(zhǎng)的紫外線產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。紫外線的主要作用是激發(fā)或催化物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)作用,除用于殺菌外,過(guò)量的紫外線照射誘發(fā)皮膚光毒性效應(yīng)。臨床表現(xiàn)主要有以下幾種:
1、光毒性皮炎:指化妝品中某些物質(zhì)能增強(qiáng)皮膚對(duì)光的敏感性,日光照射激活此類(lèi)物質(zhì)對(duì)皮膚產(chǎn)生刺激作用而導(dǎo)致皮膚損傷,與免疫無(wú)關(guān)。指甲油和唇膏中常用的著色劑,如熒光素和曙紅為光敏劑。煤焦油和瀝青等物質(zhì)中含有強(qiáng)光敏性物質(zhì)蒽、甲基蒽及熒蒽等,當(dāng)UV照射到吸收了這些物質(zhì)的皮膚時(shí),可與皮膚發(fā)生光毒性炎癥反應(yīng)。長(zhǎng)期職業(yè)接觸煤焦油和瀝青可形成職業(yè)性黑變病。
2、光變應(yīng)性接觸性皮炎:是接觸光變應(yīng)原物質(zhì)后,在暴露于光線的部位出現(xiàn)的皮膚炎癥反應(yīng),而在不接觸光的部位則不出現(xiàn)這種反應(yīng)。該變應(yīng)性反應(yīng)屬于T細(xì)胞介導(dǎo)的濕疹樣反應(yīng),表現(xiàn)以濕疹為特征,在暴露部位出現(xiàn)小皰疹和發(fā)展為大皰疹,并伴有脫屑、結(jié)痂,慢性階段可出現(xiàn)苔癬樣皮膚增厚。例如皮膚接觸含有對(duì)羥基甲酸及其酯類(lèi)物質(zhì)等變應(yīng)原的防曬化妝品,只要一次接觸日光即可發(fā)生此類(lèi)皮炎并持續(xù)1周左右。葵子麝香是重要的光變應(yīng)原,皮膚使用含該香料的化妝品可引發(fā)光變應(yīng)性皮炎,甚至可發(fā)展為持久性光敏反應(yīng)。接觸含煤焦油染料的化妝品可引起光變應(yīng)性皮炎,后期可出現(xiàn)色素沉著,也稱(chēng)之為“色素性化妝品皮炎”。常見(jiàn)的光致敏原還有磺胺類(lèi)藥物、吩噻嗪、香豆素、苯胺、香皂和除臭劑中的殺菌劑三氧N-碳酸苯胺、防曬劑中的對(duì)氨基苯甲酸衍生物。
3、職業(yè)性色素加深:過(guò)度接觸紫外線、日光、紅外線、煤焦油及其衍生物、橡膠改良劑和防老化劑,無(wú)機(jī)砷、碳素及某些染料,或從事避孕藥及氯丙嗪生產(chǎn)等,均有可能引起皮膚色素增多。波長(zhǎng)越短,透入皮膚的深度越小,照射后黑色素沉著較弱,波長(zhǎng)越長(zhǎng),透入皮膚的深度越大,照射后黑色素沉著較強(qiáng)。紫外線作用于黑色素細(xì)胞,引起黑色素在細(xì)胞內(nèi)從底部向表面轉(zhuǎn)移重新分布,造成皮膚色素增加。在UV下照射5min內(nèi),皮膚可暫時(shí)性變黑,稱(chēng)為曬斑反應(yīng),主要由長(zhǎng)波紫外線UVA引起的。
4、皮膚癌:紫外線是皮膚的主要致癌因素,鱗狀細(xì)胞癌和表皮基底細(xì)胞癌通常與慢性或過(guò)量的UV暴露相關(guān)。部分化學(xué)物質(zhì)也能誘發(fā)皮膚癌,如多環(huán)芳烴和無(wú)機(jī)砷等還參與UV致癌作用的調(diào)控。
二、光毒性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 光敏物質(zhì)的共同特點(diǎn)是能吸收300~750?nm波長(zhǎng)范圍的光線,吸收光能量后被激活而成為活躍狀態(tài)。按照光化學(xué)第一定律,只有吸收足夠的光量子才能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。因此測(cè)定被測(cè)物質(zhì)的UV/可見(jiàn)光吸收光譜是任何體外或體內(nèi)生物系統(tǒng)測(cè)試光敏特性的前提。具體測(cè)定方法可參考OECD試驗(yàn)指南101和國(guó)家GB/T9721-2006《化學(xué)試劑分子吸收分光光度法(紫外可見(jiàn)光部分)》。如果摩爾消光/吸收系數(shù)小于10L/mol-1 cm-1,則該化學(xué)物質(zhì)光吸收低,不可能具有光反應(yīng)性。不必進(jìn)行任何其它測(cè)定光化學(xué)效應(yīng)的生物學(xué)試驗(yàn),包括急性光毒性體內(nèi)和體外試驗(yàn)。
1、人體光斑貼試驗(yàn)
人體光斑貼試驗(yàn)是通過(guò)在人體皮膚表面直接敷貼受試物,并同時(shí)接受一定劑量適當(dāng)波長(zhǎng)紫外線照射的方法,檢測(cè)誘發(fā)光毒性與光變應(yīng)性皮炎的光敏劑以及檢測(cè)機(jī)體對(duì)某些光敏劑反應(yīng)的一種皮膚試驗(yàn)。方法和一般斑貼試驗(yàn)一樣,首先將被檢物貼敷在患者背部或前臂屈側(cè),同時(shí)照射UVB和UVA,測(cè)定其最小紅斑量(MED)。24~48h后以3/4MED的光線照射貼敷物的一半,再過(guò)48h觀察結(jié)果,如果僅在貼敷物+照射部位發(fā)紅,水腫或發(fā)生小丘疹(有時(shí)發(fā)生小水皰)時(shí)為陽(yáng)性反應(yīng),被檢物質(zhì)即是光感物質(zhì)。
2、光毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
將一定量受試物涂抹在動(dòng)物去毛的背部皮膚上,經(jīng)一定時(shí)間間隔后暴露于UVA光線下,觀察受試動(dòng)物皮膚反應(yīng)并確定該受試物有否光毒性。單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng),而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和為2或2以上的動(dòng)物數(shù)為1只或1只以上時(shí),判為受試物具有光毒性。
三、急性光毒性的體外替代方法 傳統(tǒng)的皮膚光毒性試驗(yàn)以動(dòng)物試驗(yàn)為主,上世紀(jì)80年代以來(lái),光毒性的體外替代試驗(yàn)得到發(fā)較快的發(fā)展,急性光毒性效應(yīng)已找到完全替代動(dòng)物試驗(yàn)的方法。目前經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的光毒性的試驗(yàn)方法共三項(xiàng),分別是體外3T3光毒性中性紅攝取試驗(yàn)(3T3-NRU-PT)、紅細(xì)胞光毒性試驗(yàn)(RBC-PT)和重建人體皮膚模型光毒性試驗(yàn)(H3D-PT),后兩種方法是3T3-NRU-PT有效和重要的輔助方法,能彌補(bǔ)3T3-NRUPT的某些不足。其它未經(jīng)驗(yàn)證的方法是酵母試驗(yàn)的光雞胚試驗(yàn)。3T3-NRU-PT是這三種方法中的核心測(cè)試法,是目前國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)要求的光毒性測(cè)試的唯一方法,但在我國(guó)還未獲得監(jiān)管部門(mén)的認(rèn)可。當(dāng)某一化學(xué)物的潛在光毒性不能由3T3-NRU-PT法獲得足夠的信息時(shí),還可以用另外兩種體外方法RBC-PT和H3D-PT。
1、3T3成纖維細(xì)胞中性紅攝取光毒性試驗(yàn)(3T3 NRU-PT)
本試驗(yàn)方法建立的基礎(chǔ)是比較有或無(wú)非細(xì)胞毒性劑量的刺激性光照射情況下化學(xué)物的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性是以受試物在光照射處理24h后,與受試物濃度相關(guān)的細(xì)胞攝取活體染料中性紅的還原量來(lái)表示的。加有不同濃度受試物的3T3細(xì)胞在96孔板中孵育1h。然后,暴露在紫外線/可見(jiàn)光(有效UVA劑量為1.67mW/cm2)50min,24h后測(cè)試中性紅在540nm處的光密度值。同時(shí),加有相同化學(xué)物的第二塊板放在暗處做對(duì)照板。通過(guò)劑量-反應(yīng)曲線的非線性擬合模型計(jì)算使細(xì)胞活性抑制50%的受試物濃度(IC50)。結(jié)果分析可采用兩種計(jì)算模型。一種是光刺激因子(PIF),定義為測(cè)得的無(wú)UVA照射和有UVA照射時(shí)IC50值的比,另一種是平均光效應(yīng)(MPE),即比較化學(xué)物在有UV光和無(wú)UV光時(shí)獲得的劑量-反應(yīng)曲線下面積,通過(guò)數(shù)學(xué)分析導(dǎo)出數(shù)值。如果PIF<2或MPE<0.1時(shí),預(yù)測(cè)“無(wú)光毒性”;如果2
5或MPE>0.15時(shí),預(yù)測(cè)“有光毒性”。
德國(guó)Battelle實(shí)驗(yàn)室最早用人的類(lèi)皮膚細(xì)胞進(jìn)行體外光細(xì)胞毒性試驗(yàn),后來(lái),Beiersdorf(德國(guó)漢堡)實(shí)驗(yàn)室用開(kāi)發(fā)了Balb/c 小鼠成纖維細(xì)胞3T3 NRU-PT光毒性試驗(yàn)方法。ZEBET的統(tǒng)計(jì)學(xué)家開(kāi)發(fā)了PIF預(yù)測(cè)模型,漢堡大學(xué)的Holzhütter等開(kāi)發(fā)了MPE預(yù)測(cè)模型。借助數(shù)據(jù)處理和分析軟件可提高檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化和效率。3T3-NRU-PT試驗(yàn)于2004年正式作為指南TG 432發(fā)布,并被EMEA(歐洲藥品管理局)、美國(guó)FDA和日本政府認(rèn)可作為監(jiān)管用途。2008年中國(guó)將其轉(zhuǎn)化為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T21769-2008)并用于化學(xué)品光毒性檢測(cè)。
2、聯(lián)合血紅細(xì)胞光毒性測(cè)試(RBC-PT)
光溶血是一種簡(jiǎn)單快速的篩選光敏感物質(zhì)的體外技術(shù),結(jié)合血紅蛋白氧化可在人體細(xì)胞水平上篩選光敏物和研究光毒性作用機(jī)制。目前標(biāo)準(zhǔn)化的RBC-PT方法測(cè)定紅細(xì)胞的兩個(gè)終點(diǎn),即光溶血和甲基化-血紅蛋白(met-Hb)形成,包括光溶血和血紅蛋白光氧化兩個(gè)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中將化學(xué)物質(zhì)與紅細(xì)胞接觸,暴露于光線一段時(shí)間,在525 nm處測(cè)定吸光度評(píng)價(jià)光溶血作用,630nm處測(cè)定吸光度評(píng)價(jià)met-Hb的形成。預(yù)測(cè)模型為兩個(gè)判定值,通過(guò)檢測(cè)光溶血因子(PHF)和最大吸光度值來(lái)確定化學(xué)物質(zhì)的光毒性。PHF≥3.0判定為光溶血陽(yáng)性,最大吸光度值(delta)ODmax≥0.05 判定為met-Hb形成陽(yáng)性。
驗(yàn)證研究認(rèn)為,RBC-PT測(cè)試與體內(nèi)試驗(yàn)終點(diǎn)具有良好的一致性,并提供兩種不同類(lèi)型的光動(dòng)力學(xué)反應(yīng)機(jī)制的信息(甲基化血紅蛋白形成表明I型反應(yīng),光紅細(xì)胞溶血效應(yīng)是原發(fā)性的II型反應(yīng))。用紅細(xì)胞的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其對(duì)太陽(yáng)光的短波UVB有耐受性,使PBC-PT測(cè)試能較長(zhǎng)時(shí)間地暴露于高劑量的UVB下,以充分獲得光毒性機(jī)理的信息。RBC-PT試驗(yàn)已完成COLIPA/ ECVAM的雙盲測(cè)試條件下的預(yù)驗(yàn)證和驗(yàn)證,有待被認(rèn)可為急性光毒性體外測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前RBC-PT已用于歐洲(德國(guó))、日本的一些實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)質(zhì)檢和部分從事體外檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室也開(kāi)展此項(xiàng)檢測(cè)。
3、人體三維皮膚模型的體外光毒性測(cè)試(H3D-PT)
三維重建皮膚模型不僅可替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用于皮膚刺激性的檢測(cè),還可用于體外測(cè)試替代光毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。3D皮膚模型可從商業(yè)途徑獲得或?qū)嶒?yàn)室自制,前提是只有嚴(yán)格質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化達(dá)到一定程度的模型才能用于體外毒性試驗(yàn)。以EpiSkinTM皮膚模型為例,該模型由成人角質(zhì)細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)分化形成多層人體表皮結(jié)構(gòu)。完整的檢測(cè)試劑盒包含12個(gè)表皮單位、必須培養(yǎng)基和無(wú)菌培養(yǎng)板。先將含EpiSkin皮膚的培養(yǎng)置于培養(yǎng)箱中備用。一塊板用于無(wú)光照條件下的不同濃度的待測(cè)化學(xué)品的測(cè)試(類(lèi)似人工皮膚模型的皮膚刺激試驗(yàn)),另一板用于有光照條件下的不同濃度的待測(cè)化學(xué)品的測(cè)試。2h后去除受試物,用無(wú)細(xì)胞毒性劑量的光線照射2h。最后進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定(MTT法)和IL-1α的測(cè)定。如果導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加25%以上或者IL-1α釋放量之差≥40 pg/ml,則這個(gè)化學(xué)物就被預(yù)測(cè)為具有光毒性,如果一個(gè)化學(xué)物即沒(méi)有引起細(xì)胞毒性增加25%,也沒(méi)有引起 IL1>40pg就被預(yù)測(cè)為無(wú)光毒性。
H3D-PT法的優(yōu)點(diǎn)在于由于重建皮膚具有代謝活性,因3A7XlTo7wG3X3U5QrMb9uQ==而可以對(duì)受試化學(xué)物質(zhì)的生物利用度進(jìn)行評(píng)價(jià)。但是對(duì)于那些不能通過(guò)局部途徑進(jìn)入皮膚、但通過(guò)系統(tǒng)途徑(例如口服或注射暴露)在皮膚具有足夠生物利用度的光毒性物質(zhì)不能檢測(cè),也不能檢測(cè)需要重復(fù)暴露后才能造成光變態(tài)反應(yīng)的弱光反應(yīng)化學(xué)物。H3D-PT試驗(yàn)不能作為評(píng)估化學(xué)物光毒性的獨(dú)立方法,但可作為3T3-NRU-PT試驗(yàn)的補(bǔ)充方法。
4、未驗(yàn)證的替代方法
酵母試驗(yàn)(yeast assay):哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間的紫外線特別是UVB暴露過(guò)于敏感,限制了其在光毒性和光遺傳毒性試驗(yàn)中的應(yīng)用。厭氧啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一種真核生物,具有對(duì)太陽(yáng)光暴露或水溶性化學(xué)物長(zhǎng)時(shí)間暴露相對(duì)不敏感的優(yōu)點(diǎn),不管水溶性受試物是油狀還是膏體狀,甚至是氧壓極低的情況(如油狀或奶油狀)都可以檢測(cè)。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞和其它試驗(yàn)生物相比,利用啤酒酵母檢測(cè)化學(xué)品的光毒性相對(duì)簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì),可以快速進(jìn)行定量和定性檢測(cè)。厭氧酵母增殖試驗(yàn)是基于化學(xué)物質(zhì)與細(xì)胞、器官或DNA的光動(dòng)力學(xué)反應(yīng),通過(guò)比較光照和非光照條件下,檢測(cè)與化學(xué)物質(zhì)接觸24h后的細(xì)胞增殖率或克隆形成能力來(lái)評(píng)價(jià)光照下化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
光雞胚試驗(yàn)(photo hen’s egg t