嚴(yán)澤軍，程 躍，蔣軍輝，胡嘉盛，施小東，黃堅(jiān)成

腫瘤靶向性基因治療是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，其基本原理是將具有組織特異性的啟動(dòng)子序列與抑癌基因整合，通過該啟動(dòng)子，使抑癌基因只在特定的組織細(xì)胞中表達(dá)，從而提高腫瘤治療的靶向特異性，減少或避免治療過程中對(duì)正常組織細(xì)胞造成損害。為了解決基因治療的靶向性，本課題組構(gòu)建了的含有Survivin啟動(dòng)子和富含亮氨酸重復(fù)和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域1（tandem leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1，LRIG1）基因的重組腺病毒載體Ad-Surp-LRIGl，檢測(cè)了其對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞生長的影響，證實(shí)該載體具有良好的靶向性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料 RPMI-1640（Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青公司），質(zhì)粒提取純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Promega公司），各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶（Takara公司），Lipofectamine2000（Invitrogen公司），含有5型腺病毒的骨架質(zhì)粒Pbhge3（Microbix Biosystems公司）均購自武漢古泰生物公司。含LRIG1基因的質(zhì)粒pLRIGl-GFP由瑞典Umea大學(xué)的Hedman教授惠贈(zèng)，含Survivin啟動(dòng)子的pSurp-EGFP質(zhì)粒和感受態(tài)大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室制備。PCR引物合成和測(cè)序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。含LRIG1基因的重組腺病毒載體AD-LRIG1由本課題組前期構(gòu)建［1］，用作對(duì)照組。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞株BIU87（北京大學(xué)泌尿外科研究所），人胚腎293細(xì)胞（HEK293）、人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1（美國典型物保藏中心）分別培養(yǎng)于含10％胎牛血清、青霉素100U/mL及鏈霉素100μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞在相對(duì)濕度為95％、37℃、5％CO2的環(huán)境中單層生長，每3d換液傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 pEGFP-Surp-LRIGl的構(gòu)建 用KpnⅠ單酶切包含Survivin啟動(dòng)子的pSurp-EGFP質(zhì)粒，回收線性化質(zhì)粒片斷，T4DNA聚合酶平兩端，再用NheⅠ酶切，回收大小為440bp的目的片斷（即Survivin啟動(dòng)子）待用。用EcoRⅠ單酶切pLRIGl-GFP后回收線性化質(zhì)粒片斷，T4DNA聚合酶填平兩端后，再用NheⅠ酶切，回收整個(gè)線性化質(zhì)粒片斷（即自多克隆酶切位點(diǎn)切除了38bp的pLRIGl-GFP，大小約8.7kb）。將以上兩片段用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取克隆，抽提質(zhì)粒DNA。再用EcoRⅠ和NheⅠ酶雙酶切鑒定，能切出440bp的Survivin啟動(dòng)子片段，將酶切鑒定正確的陽性克隆命名為pEGFP-Surp-LRIGl。

1.4 重組腺病毒載體的構(gòu)建和鑒定 將質(zhì)粒pEGFP-Surp-LRIGl與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒Pbhge3通過Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞（操作按說明書進(jìn)行），待出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，用病毒DNA提取試劑盒提取腺病毒DNA，用LRIG1引物和Survivin引物做PCR鑒定，LRIG1的引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件參照本課題組的前期報(bào)道［2］，Survivin的設(shè)計(jì)引物為上游：5′-CTGGTACCGCAATGGCACAAT-3′；下游5′-GTGCTAGCCGCACGCCCTCTT-3′；片段長度440bp，反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性60s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為Ad-Surp-LRIGl，即Survivin啟動(dòng)子調(diào)控的攜帶LRIG1基因的復(fù)制缺陷型腺病毒。

1.5 重組腺病毒的擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定 取0.5μL首次擴(kuò)增的病毒保存液于5×106個(gè)HEK293細(xì)胞在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育72h，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，離心，收集上清反復(fù)擴(kuò)增至需要的病毒量。氯化銫梯度離心純化病毒，以50％細(xì)胞培養(yǎng)物感染量（50％tissue culture infective dose，TCID50）法測(cè)定病毒滴度。

1.6 重組腺病毒轉(zhuǎn)染率的測(cè)定 將Ad-Surp-LRIGl和AD-LRIG1分別轉(zhuǎn)染BIU87細(xì)胞和SV-HUC-1細(xì)胞，參照文獻(xiàn)進(jìn)行培養(yǎng)［3］，計(jì)算病毒轉(zhuǎn)染效率。

1.7 重組腺病毒Ad-Surp-LRIGl的體外抑瘤實(shí)驗(yàn)消化、收集處于對(duì)數(shù)生長期的BIU87細(xì)胞，并調(diào)成濃度為1×103/mL的單細(xì)胞懸液，接種于用96孔培養(yǎng)板中，每孔150μL，于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁。分為3組，Ad-Surp-LRIGl組、AD-LRIG1組、PBS組，每組設(shè)21個(gè)復(fù)孔，各組分別加入上述重組腺病毒（MOI=25），每天各組取3孔用MTT比色法［4］進(jìn)行檢測(cè)。參照波長630nm，檢測(cè)波長570nm，根據(jù)測(cè)定的A值繪制細(xì)胞生長曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用±s）表示，計(jì)數(shù)資料用率表示。組間計(jì)量資料比較采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-Surp-LRIGl的酶切鑒定 用EcoRⅠ和NheⅠ雙酶切pEGPF-Surp-LRIGl后，顯示440bp和8.7kb兩條帶；用BamHⅠ和NheⅠ雙酶切pEGPF-Surp-LRIGl后，顯示4.44kb和4.7kb兩條帶（見圖1）。酶切結(jié)果均與理論推算值一致。

圖1 pEGFP-Surp-LRIGl的酶切鑒定

2.2 Ad-Surp-LRIGl病毒的鑒定 用LRIG1引物和Survivin的上下游引物做PCR鑒定，分別擴(kuò)增出892bp的LRIG1和440bp的Survivin條帶，說明重組腺病毒中帶有Survivin啟動(dòng)子及LRIG基因片段（見圖2）。

圖2 Ad-Surp-LRIGl病毒的鑒定

2.3 重組腺病毒的擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定 將Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIG分別轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光蛋白顯著表達(dá)，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。Ad-Surp-LRIGl病毒滴度為1.4×1010pfu/mL，Ad-LRIG1病毒滴度為1.7×1011pfu/mL。

2.4 重組腺病毒轉(zhuǎn)染率的測(cè)定 倒置熒光顯微鏡下觀察顯示，加入重組腺病毒Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIG1后12h，倒置熒光顯微鏡下即可觀察到綠色熒光的BIU87細(xì)胞。2d后鏡下觀察，當(dāng)MOI=25時(shí)，Ad-Surp-LRIGl在BIU87細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率為74.56％，在SV-HUC-1細(xì)胞中無表達(dá)，轉(zhuǎn)染率為0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=58.64，P＜0.05）。Ad-LRIGl在BIU87細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率為68.27％，在SV-HUC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染率為72.52％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.075，P＞0.05）。Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在BIU87細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.016，P＞0.05）。

2.5 重組腺病毒對(duì)BIU87細(xì)胞生長抑制作用 常規(guī)培養(yǎng)1d，PBS組的細(xì)胞A值即開始超過Ad-Surp-LRIGl組和Ad-LRIGl組細(xì)胞A值，隨著時(shí)間的延長，這一差異逐步增大，第4d時(shí)這一差異顯著（F=15.96，P＜0.05）。提示轉(zhuǎn)染了LRIG1基因的BIU87細(xì)胞生長速度比PBS組的BIU87細(xì)胞生長速度慢，而Ad-Surp-LRIGl組和Ad-LRIGl組細(xì)胞生長速度無明顯差異（圖3）。

3 討論

重組腺病毒載體因能廣泛轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞而在腫瘤的基因治療中被運(yùn)用，但由于其轉(zhuǎn)染細(xì)胞沒有特異性，除了能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物外，還會(huì)在正常細(xì)胞中表達(dá)這些產(chǎn)物，從而帶來某些潛在的毒副作用。而病毒在體內(nèi)的復(fù)制本身就會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生影響［5］。因此，如何調(diào)控重組腺病毒載體在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制并表達(dá)目的基因產(chǎn)物，最大限度地避免治療的副作用，是目前基因治療研究的熱點(diǎn)［6］。

Survivin基因是一種抗凋亡基因，其表達(dá)產(chǎn)物Survivin蛋白在包括膀胱癌在內(nèi)的許多腫瘤內(nèi)大量表達(dá)，而在正常組織中則不表達(dá)［7］。Survivin基因中含有多轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，該位點(diǎn)內(nèi)的Survivin啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Survivin基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些因子上調(diào)了Survivin啟動(dòng)子活性，啟動(dòng)了Survivin基因的表達(dá)，從而造成腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞內(nèi)Survivin蛋白的表達(dá)差異［8］。因此，將Survivin啟動(dòng)子用于表達(dá)載體中調(diào)控目的基因的表達(dá)時(shí)，只會(huì)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)目的基因產(chǎn)物，從而起到增強(qiáng)基因治療特異性及降低其毒副反應(yīng)的效果。而將Survivin啟動(dòng)子克隆至腺病毒載體上取代其原有啟動(dòng)子時(shí)，由于Survivin啟動(dòng)子也同時(shí)調(diào)控了病毒本身結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，因而這種重組腺病毒僅能在Survivin陽性細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，即為“條件復(fù)制型腺病毒”，從而避免了腺病毒復(fù)制對(duì)正常細(xì)胞的影響。

LRIG1屬于LRIGs基因家族。LRIGs是新近發(fā)現(xiàn)的一類基因，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該家族至少包括三個(gè)成員：LRIG1、LRIG2和LRIG3。它們的編碼產(chǎn)物為一類結(jié)構(gòu)相似的胞外段有多個(gè)亮氨酸重復(fù)序列和Ig樣結(jié)構(gòu)域的跨膜糖蛋白。人、鼠的LRIGs基因和蛋白具有廣泛同源性。Gur等［9］研究發(fā)現(xiàn)，LRIG1除了通過其胞外段直接與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合，抑制EGF同EGFR結(jié)合之外，還能夠增加EGFR對(duì)泛素化配體C-cbl的募集和結(jié)合，導(dǎo)致EGFR降解，從而進(jìn)一步起到阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、加快細(xì)胞凋亡的作用。EGFR是一種跨膜酪氨酸蛋白激酶生長因子受體，與人類腫瘤關(guān)系密切，其表達(dá)在包括膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤中有明顯增高［10］。在多種腫瘤組織中，存在著LRIG1表達(dá)下調(diào)或消失以及EGFR/LRIG1比例上升的情況。此外，LRIG1基因定位于人染色體3p14.3，而這個(gè)位點(diǎn)正是多種抑癌基因缺失的好發(fā)部位。我們的前期研究顯示［11-12］，人膀胱癌細(xì)胞系BIU87轉(zhuǎn)染野生型LRIG1基因后，細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力受到明顯抑制。因此可以推測(cè)，構(gòu)建攜帶有Survivin啟動(dòng)子和抑癌基因LIRG1的重組條件復(fù)制型腺病毒，不僅能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)目的基因產(chǎn)物，起到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，還不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成不良影響，盡可能避免目前基因治療的很多副反應(yīng)。本研究顯示，Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在體外均能明顯抑制BIU87細(xì)胞的生長。Ad-LRIGl在膀胱癌細(xì)胞BIU87和人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1均有表達(dá)，而Ad-Surp-LRIGl只在BIU87細(xì)胞中表達(dá)，在SV-HUC-1中不表達(dá)，表明Ad-Surp-LRIGl具有腫瘤特異性。

圖3 MTT法檢測(cè)BIU87細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組病毒后的生長曲線

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了Survivin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)LRIG1基因表達(dá)的重組腺病毒Ad-Surp-LRIGl，由于Survivin啟動(dòng)子只在表達(dá)Survivin蛋白的腫瘤細(xì)胞中調(diào)控基因的表達(dá)，所以可以利用其驅(qū)動(dòng)治療基因特異地表達(dá)，實(shí)現(xiàn)腫瘤的基因治療，最大限度地降低基因治療可能存在的副作用。

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