武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院胃腸外科（西安710054） 盧 翔 段 煒 張 力 李會(huì)文 李向陽 王周勤

急性壞死性胰腺炎（Acute necrotizing pancreatitis，ANP）腸道粘膜損傷的本質(zhì)是由一系列炎癥因子或介質(zhì)介導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)和炎癥損傷，可繼發(fā)腸道屏障功能衰竭，腸腔內(nèi)細(xì)菌及毒素移位，并進(jìn)一步激發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），腸道作為SIRS的原動(dòng)力，ANP發(fā)生后NF－κB可活化并產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，加劇腸道粘膜的損傷［1，2］，這些促炎性細(xì)胞因子、趨化因子、粘附因子等基因的活化和表達(dá)表明核因子κB（NF－κB）的活化可能是其中的關(guān)鍵因素；有報(bào)道生長(zhǎng)激素（Growth hormone，GH）具有維護(hù)ANP腸粘膜屏障功能，促進(jìn)腸上皮修復(fù)，減少腸道細(xì)菌和毒素移位作用［3］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察ANP腸粘膜絨毛細(xì)胞（IMN）中 NF－κB的 表達(dá) 情 況，初步探討GH對(duì)ANP腸粘膜NF－κB活化及其介導(dǎo)炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)分組及急性壞死性胰腺炎（ANP）模型制備健康成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。以數(shù)字表法將動(dòng)物隨 機(jī) 分 成 三組：正常對(duì)照組、ANP組及GH處理組（處理組）。ANP模型制備：大鼠術(shù)前禁食12h，不禁水。20% 烏拉坦溶液（0．5ml／kg）腹腔注射麻醉，正中切口入腹，于肝十二指腸韌帶近肝門側(cè)用小動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉胰膽管，由十二指腸前壁進(jìn)針，進(jìn)入胰膽管內(nèi)，夾閉胰膽管出口，以0．1ml／min勻速逆行注入5% ?；悄懰徕c（1ml／kg），10min后去除動(dòng)脈夾，關(guān)腹。處理組在ANP模型制成前30min經(jīng)尾靜脈注射GH（0．75U／kg）。正常對(duì)照組自胰膽管內(nèi)逆行注入等量生理鹽水。

2 觀察指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)方法

2．1 取材：末段回腸粘膜絨毛灌洗、細(xì)胞留取及各組動(dòng)物手術(shù)后6h處死，然后取材。所有標(biāo)本均重復(fù)檢查2次。在動(dòng)物處死后行末端回腸灌 洗，收 集 灌 洗液（TILF）。留取少量灌洗液，用于測(cè)定腫瘤壞死 因 子 －α（TNF－α）、白 細(xì) 胞 介 素1β（IL－1β）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、細(xì)胞間粘附分子（ICAM－1）和單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP－1）。將 剩余灌洗液離心獲取細(xì)胞沉淀，備用。大鼠末端回腸用于組織學(xué)檢查。

2．2 病理形態(tài)學(xué)檢查：將各組大鼠的末端回腸置10% 甲醛溶液中浸泡，石蠟包埋，行蘇木精 －伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察回腸組織學(xué)改變。

2．3 BALF中腫 瘤 壞 死 因 子 －α（TNF－α）、白細(xì) 胞 介 素1β（IL－1β）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、細(xì)胞間粘附分子（ICAM－1）和單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP－1）測(cè)定：應(yīng)用 BioSoure公 司 的 TNF－ α、IL－1β、iNOS、ICAM－1和MCP－1酶 聯(lián) 免 疫 吸 附法（ELISA）試劑盒測(cè)定，嚴(yán)格按照說明書操作。

2．4 Western blot檢 測(cè) NF－κB含 量：應(yīng)用北京普利萊公司胞核 －胞漿蛋白制備試劑盒提取腸粘膜組織核蛋白并測(cè)定濃度后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果行計(jì)算機(jī)掃描，用圖像分析系統(tǒng)，測(cè) 定 目 的 條 帶 與內(nèi) 參 的 光 密 度 值（OD）。并取兩者的比值作半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性采用線性分析，應(yīng)用SPSS13．0分析軟件分別對(duì)各組的均數(shù)行統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理。P＜0．05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腸粘膜組織大體變化及病理組織學(xué)所見：對(duì)照組大鼠腸粘膜呈粉紅色，表面光滑，無滲出及出血；光學(xué)顯微鏡下見腸粘膜絨毛組織結(jié)構(gòu)清晰，腸粘膜細(xì)胞壁薄，腸粘膜內(nèi)未見滲出液。ANP組肉眼見整個(gè)腸粘膜充血，間有斑片狀壞死，鏡下見腸粘膜間質(zhì)水腫，彌漫性出血，腸粘膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，血管擴(kuò)張淤血，有大 量 炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸粘膜內(nèi)有炎性滲出。GH處理組上述變化較ANP組明顯減輕（圖1）。

圖1 各組腸粘膜組織病理切片（HE×200） A：ANP組；B：對(duì)照組；C：GH處理組（圖片A、C中，箭頭所指為細(xì)胞病理改變）

2 腸粘膜組織中 TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和MCP－1含量的變化：正 常 大 鼠腸粘膜組織中TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和 MCP－1含量 較 低，處 理 組 與正常對(duì)照組相比，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ANP組各項(xiàng)指標(biāo)均高于正常對(duì)照組和處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0．05），見表1。

表1 腸粘膜組織中 TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和 MCP－1含量 （±s）

表1 腸粘膜組織中 TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和 MCP－1含量 （±s）

注：＊與對(duì)照組比較P＜0．05；△與ANP組比較P＜0．05

組 別 TNF－α（pg／ml） IL－β（pg／ml） iNOS（pg／ml） ICAM－1（pg／ml） MCP－1（pg／ml）對(duì)照組 6．34±0．64 4．08±1．92 0．08±0．03 0．26±0．04 0．13±0．01 ANP組 8．71±0．89＊ 33．05±11．20＊ 0．17±0．02＊ 0．75±0．21＊ 0．20±0．05＊GH組 7．44±0．58△ 10．15±3．68△ 0．07±0．04△ 0．58±0．15△ 0．16±0．06△

3 各組腸粘膜絨毛核蛋白中NF－κB P65活性：NF－κB P65在 對(duì) 照 組 的腸粘膜絨毛核 蛋 白 中 表 達(dá)程度最低，在ANP組中呈高表達(dá)，在GH處理組呈中度表達(dá)（圖2），見表2。

4 相關(guān)性分析：在ANP組，腸粘膜組織中NF－κB P65的表達(dá)呈高度相關(guān)（r＝－0．706，P ＝0．015）；在 GH處理組，腸粘膜組織中NF－κB P65的表達(dá)呈中度相關(guān)（r＝－0．572，P ＝0．019）。

圖2 各組腸粘膜絨毛核蛋白中的NF－κB表達(dá)

表2 腸粘膜組織核蛋白中NF－κB P65／β－actin相對(duì)量（±s）

表2 腸粘膜組織核蛋白中NF－κB P65／β－actin相對(duì)量（±s）

注：＊與對(duì)照組比較P＜0．05；△與ANP組比較P＜0．05

組 別 NF－κB P65／β－actin對(duì)照組0．08±0．03 ANP組 0．18±0．06＊GH組 0．11±0．04△

討 論

急性壞死性胰腺炎可激發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生，腸道受缺血、缺氧等因素的刺激，在腸粘膜絨毛細(xì)胞合成大量細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)，一方面加重腸道屏障功能的損害、衰竭，另一方面則促使全身炎癥反應(yīng)不斷擴(kuò)大［4］。目前有研究報(bào)道，核因子－κB（Nuclear factorκB，NF－κB）是調(diào)控多種炎性因子基因表達(dá)的樞紐，是一重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)，活化后啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞因子、粘附分子和趨化因子的啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ANP組IMN中NF－κB表達(dá)活性明顯高于正常對(duì)照組及處理組；TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和 MCP－1的 表 達(dá) 較 正 常 對(duì) 照 組及處理組明顯升高。提示在ANP時(shí)有NF－κB的大量激活，導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)的過量釋放，使炎癥反應(yīng)持續(xù)加重，進(jìn)一步加重腸粘膜損傷。近來發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素（GH）具有維護(hù)ANP腸粘膜屏障功能，促進(jìn)腸上皮修復(fù)，減少腸道細(xì)菌和毒素易位的作用。提示GH可防止腸上皮細(xì)胞過度凋亡，下調(diào)炎癥介質(zhì)的釋放，具有抗炎效應(yīng)［6］。GH具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)燒傷、創(chuàng)傷、感染等患者正氮平衡的恢復(fù)和創(chuàng)面組織生長(zhǎng)，同時(shí)還可維持腸粘膜正常結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸粘膜功能的恢復(fù)［7］；本研究觀察發(fā)現(xiàn)GH下調(diào)它們的表達(dá)，提示GH可能通過降低TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和 MCP－1的表達(dá)影響局部白細(xì)胞浸潤(rùn)，從而減輕腸粘膜屏障的炎性損傷。

核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB是由可誘導(dǎo)的3個(gè)亞基組成的復(fù)合物，3個(gè)亞基分別為轉(zhuǎn)錄因子二聚體（P50和P65）和抑制亞基Ⅰ－κB。NF－κB由于ⅠκB的抑制作用主要以非活性形態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子NF－κB在許多領(lǐng)域受到研究者的關(guān)注基于以下的幾點(diǎn)：罕見和快速的調(diào)節(jié)性，控制的基因范圍廣，在免疫過程處于中樞的角色，亞基的復(fù)雜性和牽涉若干個(gè)疾病?？刂芅F－κB的基本水平是通過與抑制蛋白ⅠκB的相互作用。最近的證據(jù)證實(shí)了不同機(jī)制調(diào)節(jié) NF－κB的IκB多樣形態(tài)存在。NF－κB可以被脂肪酶、脂多糖或者炎癥細(xì)胞因子激活例如TN F、IL－1、病毒感染、某一個(gè)病毒基因產(chǎn)物的表達(dá)、紫外線照射、B或T細(xì)胞活化、其他生理學(xué)的和非生理學(xué)的刺激物。NF－κB激活轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核是通過ⅠκB定向磷酸化、降解，與NF－κB解離進(jìn)行的。NF－κB一旦轉(zhuǎn)入細(xì)胞核即結(jié)合同族DN A序列和激活特異靶基因轉(zhuǎn)錄，大多數(shù)是編碼免疫和炎癥的重要蛋白。NF－κB／Rel因子控制大范圍的基因表達(dá)，例如編碼免疫球蛋白、細(xì)胞因子、化學(xué)增活素、干擾素、主要組織相容性復(fù)合物蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附分子。NF－κB可與許多基因的啟動(dòng)子結(jié)合，包括炎癥應(yīng)答例如ICAM－1、E－選擇蛋白、VCAM、TNF－α、IL－1、IL－2、IL－6、IL－8、COX2 和iNOS［8～13］。因此，核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵角色。本研究用P65單抗結(jié)合伊紅復(fù)染細(xì)胞漿檢測(cè)大鼠腸粘膜細(xì)胞核內(nèi)P65亞單位，正常狀態(tài)P50／P65復(fù)合體只存在于細(xì)胞漿，因此該方法可以觀察NF－κB的活化情況。結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組腸粘膜陽性細(xì)胞數(shù)很少，而ANP組可發(fā)現(xiàn)大量NF－κB P65陽性細(xì)胞數(shù)；說明在ANP早期腸粘膜NF－κB就大量活化，介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大。NF－κB P65陽性細(xì)胞主要為腸絨毛頂端的上皮細(xì)胞及其下面的單核細(xì)胞，可能因?yàn)槟c絨毛頂端作為接觸毒素的最前沿，因而該處的炎癥反應(yīng)也最強(qiáng)烈。

本研究發(fā)現(xiàn)GH處理組NF－κB P65陽性細(xì)胞較ANP組明顯減少，說明GH有抑制NF－κB活化作用。結(jié)合GH能顯著下調(diào)ANP腸組織NF－κB介導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)，從而進(jìn)一步揭示NF－κB及其介導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)參與了ANP腸道粘膜的損傷的發(fā)生。GH對(duì)ANP腸道的保護(hù)作用與GH下調(diào)腸粘膜細(xì)胞因子表達(dá)、抑制NF－κB活化有關(guān)。

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