俞 嵐 周 蕾 宋文慶 武世伍 王丹娜

（蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床病理科；蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室；安徽省感染與免疫重點實驗室，安徽233030）

在世界范圍內(nèi)，卵巢癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中占3%－4%，是婦科惡性腫瘤導(dǎo)致病人死亡的首要原因［1］。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是卵巢癌重要的轉(zhuǎn)移途徑，是卵巢癌臨床治療中一個最棘手的問題，也是造成患者死亡的重要原因。MMP－7（matrix metalloproteinases－7，MMP－7）是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族中分子量最小的一員，為28 k D，具有降解細(xì)胞外基質(zhì) （extracellular matrix，ECM）的功能，進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞運(yùn)動能力，參與多種惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程［2］。VEGF－C能夠促進(jìn)新生淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增加淋巴管通透性，并利于細(xì)胞在淋巴管內(nèi)移動，因此對于介導(dǎo)腫瘤淋巴管形成和腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用［3］。D2－40［4］是近年來發(fā)現(xiàn)的一種能與癌胚抗原M2A特異性結(jié)合的單克隆抗體，能特異性標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，而并不標(biāo)記血管內(nèi)皮，是目前階段淋巴管較好的特異性標(biāo)記物之一。本研究通過對80例卵巢上皮性癌以及20例良性上皮性腫瘤組織 MMP－7、VEGF－C的表達(dá)以及 D2－40標(biāo)記的淋巴管密度（microlymphatic vessel density，MLVD）進(jìn)行檢測，探討它們與卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的關(guān)系。

材料和方法

1.一般資料

選擇蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2000年1月－2002年12月存檔蠟塊EOC組織標(biāo)本80例（術(shù)前未行放、化療），所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截止2010年11月，隨訪時間為7－96個月。根據(jù)UICC2002版PTNM病理分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，早期（FIGOⅠ、Ⅱ期）卵巢癌43例，晚期（FIGO Ⅲ、Ⅳ期）卵巢癌37例；漿液性癌63例，黏液性癌10例，子宮內(nèi)膜樣癌7例；有腹腔臟器及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，有腹水者21例。年齡19－76歲，中位年齡52.0歲，≥60歲33例，＜60歲47例；腫瘤長徑D≥6.0cm 48例，D＜6.0cm 32例。選擇卵巢良性上皮性腫瘤20例作為對照組。復(fù)閱上述患者的病理切片，選取存檔標(biāo)本石蠟塊進(jìn)行切片，厚度4μm。

2.試劑

鼠抗人MMP－7單克隆抗體（克隆系：1D2）及兔抗人VEGF－C多克隆抗體均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。鼠抗人D2－40單克隆抗體（克隆系：D2－40），Elivision TM plus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

3.實驗方法

3.1 免疫組織化學(xué)Elivision TM plus法

將石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，烤干，于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組化染色操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。采用已知陽性片作對照，以PBS液代替一抗作空白對照。

3.2 微淋巴管密度（MLVD）計數(shù)

D2－40主要表達(dá)在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，從而可以通過D2－40的陽性染色進(jìn)行MLVD計數(shù)，計數(shù)方法參照修改過的 Weidner［5］法進(jìn)行。

4.結(jié)果判定

MMP－7及VEGF－C免疫組化陽性染色均為腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒或團(tuán)塊。采取二次計分法：每例標(biāo)本隨機(jī)計數(shù)5個高倍視野（×400），計數(shù)每個高倍視野中陽性細(xì)胞所占百分比并計分。首先將染色強(qiáng)度計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再將陽性細(xì)胞百分比計分，0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞為＜10%，2分為11%－50%，3分為51%－75%，4分為＞75%。用染色強(qiáng)度得分和細(xì)胞數(shù)得分的乘積作為判斷表達(dá)結(jié)果，若積分≤2為陰性，＞2為陽性。免疫組化結(jié)果由高年資病理醫(yī)師讀片評定。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩個樣本間均數(shù)的比較采用成組t檢驗，多個樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，各組率的比較采用χ2檢驗及Fisher exact法檢驗。各指標(biāo)間相關(guān)性采用Spearman檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.EOC及卵巢良性上皮性腫瘤組織中MMP－7及VEGF－C蛋白的表達(dá)

EOC中 MMP－7及VEGF－C表達(dá)陽性率分別為60.0%（48／80）、57.5%（46／80）（圖1、2），卵巢良性腫瘤組上述指標(biāo)表達(dá)陽性率分別為25.0%（5／20）、25.0%（5／20），兩組間 MMP－7及 VEGF－C表達(dá)陽性率差異分別具有顯著性（P＜0.05）（表1）。

表1 EOC及卵巢良性上皮性腫瘤中MMP－7、VEGF－C及MLVD的表達(dá)Table 1 Expression of MMP－7，VEGF－C and MLVD in EOC and benign epithelial ovarian tumor

圖1 MMP－7蛋白在卵巢漿液癌中的陽性表達(dá)（Elivision TM×400）圖2 VEGF－C蛋白在卵巢漿液癌中的陽性表達(dá)（Elivision TM×400）圖3 卵巢上皮性癌組織周邊區(qū)淋巴管呈擴(kuò)張狀不規(guī)則形，管腔內(nèi)可見癌栓（Elivision TM×400）圖4 卵巢上皮性癌組織中心區(qū)淋巴管減少呈閉鎖狀態(tài)（Elivision TM×400）Fig.1 Expression of MMP－7 protein was observed in ovarian serous carcinoma（Elivision TM×400）Fig.2 Expression of VEGF－C protein was observed in ovarian serous carcinoma（Elivision TM×400）Fig.3 The peritumoral lymphatic vessels in EOC，showing irregular－shaped expansion，black arrow is cancer embolus in the lymphatic vessels（Elivision TM×400）Fig.4 Small number of lymphatic vessels showing in the central area of EOC，red arrow is cord－like closed lymphatic vessels（Elivision TM×400）

2.卵巢EOC及良性上皮性腫瘤組織中D2－40標(biāo)記的MLVD的形態(tài)及分布

腫瘤間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞形成的條狀、裂隙狀結(jié)構(gòu)或者呈現(xiàn)有管腔的結(jié)構(gòu)即為淋巴管。EOC組織與卵巢良性上皮性腫瘤組織中的淋巴管結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞形態(tài)沒有明顯差異。EOC中，D2－40標(biāo)記陽性的微淋巴管主要位于癌巢周圍的間質(zhì)內(nèi)，管壁薄，形狀多不規(guī)則，管腔內(nèi)無紅細(xì)胞成分，有的腔內(nèi)可見癌栓（圖3）。EOC組織癌巢內(nèi)D2－40標(biāo)記陽性的微淋巴管數(shù)目明顯減少，或見到少數(shù)管腔受壓呈裂隙狀的結(jié)構(gòu)（圖4）。EOC組織中，D2－40標(biāo)記的 MLVD為13.09±6.16，良性腫瘤組MLVD為9.25±4.33，兩組間MLVD的差異具有顯著性（P＜0.05）（表1）。

表2 80例EOC組織中MMP－7、VEGF－C的表達(dá)及MLVD與臨床病理因素的關(guān)系Table 2 Correlation of expression of MMP－7，VEGF－C and MLVD to clinicopathologic indexes of 80 cases of EOC

3.EOC組織中 MMP－7、VEGF－C蛋白的表達(dá)及MLVD與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

MMP－7、VEGF－C 的 表 達(dá) 及 D2－40 標(biāo) 記 的MLVD數(shù)目在EOC中與患者的年齡、腫瘤的組織學(xué)類型、腫瘤大小差以及患者有無腹水差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；三個指標(biāo)的表達(dá)在臨床分期Ⅲ－Ⅳ期中分別為83.8%、83.8%、16.65±4.15均高于Ⅰ－Ⅱ期39.5%、34.9%、10.02±5.99（P＜0.05），高、中和低分化組 MMP－7蛋白陽性表達(dá)率分別為29.4%、56.7%和78.8%，VEGF－C蛋白陽性表達(dá)率分別為11.8%、60.0%和78.8%，MLVD計數(shù)分別為7.29±2.85、12.63±6.25和16.48±4.94，MMP－7、VEGF－C陽性表達(dá)率及MLVD均隨著腫瘤惡性級別的增高而顯著增加（P＜0.05），有腹腔器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者均高于無轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）（表2）。

4.EOC中 MMP－7、VEGF－C的表達(dá)與 MLVD及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析顯示，在EOC中 MMP－7的表達(dá)陽性組 MLVD為16.23±5.01，MMP－7的表達(dá)陰性組MLVD為8.38±4.53，MMP－7的表達(dá)與患者M(jìn)LVD及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性（r分別為0.510，0.521，P 均＜0.01）；VEGF－C的表達(dá)陽性組MLVD為16.02±5.24，VEGF－C的表達(dá)陰性組MLVD為9.12±4.87，VEGF－C的表達(dá)也分別與患者M(jìn)LVD及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性。（r分別為0.455，0.565，P均＜0.01）

討 論

卵巢癌是婦科惡性腫瘤死亡的主要原因，由于其起病時隱匿，所以75%的患者在就診時已是晚期階段，常形成復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差［6］。作為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的一條主要路線，淋巴管形成成為腫瘤進(jìn)展的一個重要步驟。臨床及實驗?zāi)Ｐ鸵呀?jīng)證實，淋巴管形成也是卵巢癌惡性進(jìn)展的關(guān)鍵步驟［7］。因此，尋找到可靠的能夠判斷患者預(yù)后的分子指標(biāo)并且澄清腫瘤細(xì)胞從卵巢播散至區(qū)域淋巴結(jié)的具體機(jī)制迫在眉睫。

基質(zhì)金屬蛋白酶－7（Matrix metalloproteinase－7，MMP－7）也被稱為基質(zhì)溶素，可以特異性的表達(dá)于上皮性腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而并不表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)［8］。MMP－7具有強(qiáng)大的EMC降解活性，特異性地降解EMC中的膠原纖維，彈性蛋白，層粘連蛋白，明膠和蛋白多糖等多種重要成分，同時也參與了非EMC蛋白的活化、降解等生化調(diào)節(jié)過程。由于細(xì)胞外基質(zhì)的降解是癌癥發(fā)生、發(fā)展以及惡性進(jìn)展的重要步驟，所以MMP－7的表達(dá)對于早期階段腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。不僅如此，腫瘤的發(fā)生是一個復(fù)雜的綜合過程，涉及了腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管及淋巴管的形成，MMP－7的在人類惡性腫瘤組織過表達(dá)，與上述腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)［9］。多項研究顯示，MMP－7的表達(dá)與結(jié)腸癌［10］、胰腺癌及膽道系統(tǒng)惡性腫瘤［11］的惡性進(jìn)展相關(guān)。同時，大量研究也證實［12－16］，MMP－7可以作為預(yù)測肝內(nèi)膽管腺癌、大腸癌、非小細(xì)胞肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌及甲狀腺乳頭狀癌等惡性腫瘤患者的獨立預(yù)后因子。本實驗結(jié)果顯示，MMP－7蛋白陽性表達(dá)在臨床分期Ⅲ－Ⅳ期顯著高于Ⅰ－Ⅱ期（P＜0.01），并且隨著腫瘤惡性級別的增高，MMP－7的陽性表達(dá)也顯著增加（P＜0.01），在伴有腹腔器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無轉(zhuǎn)移組（P＜0.01）。這說明，MMP－7在EOC中的表達(dá)越高，癌組織的分化越差、分期越晚、越容易伴發(fā)轉(zhuǎn)移，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報道具有一致性。MMP－7在有效降解基底膜成分的同時，也能對血管壁及淋巴管壁的彈性蛋白具有很強(qiáng)的分解作用，有文獻(xiàn)提示伴有MMP－7高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞更容易突破血管壁和淋巴管壁，促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Graesslin［17］等研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中 MMP－7的高表達(dá)與腫瘤淋巴管侵犯之間存在相關(guān)性。實驗進(jìn)一步證實了MMP－7的表達(dá)上調(diào)可能有促進(jìn)EOC發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的作用。

長期以來，人們已知很多腫瘤的轉(zhuǎn)移是通過淋巴管進(jìn)入?yún)^(qū)域淋巴結(jié)而發(fā)生的。淋巴管生成被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因素。在此過程中，血管內(nèi)皮生長因子家族成員及其受體可能發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。VEGF－C是近年來發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)腫瘤淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因子之一，VEGF－C與其特異性受體VEGFR－3在體內(nèi)通過旁分泌的形式相互結(jié)合，作用于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，使其增殖，促進(jìn)腫瘤的微淋巴管新生，同時通過調(diào)節(jié)原有淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞分泌形式，促進(jìn)原有淋巴管的增生，并與新生微淋巴管相互吻合形成廣泛的淋巴管網(wǎng)，使腫瘤細(xì)胞易于通過淋巴管間的吻合進(jìn)入淋巴管，并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔部位［18］。近年來有觀點認(rèn)為，惡性腫瘤是全身性疾病，早期即有腫瘤細(xì)胞播散進(jìn)入循環(huán)，腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是在VEGF－C介導(dǎo)下的主動過程［19］。近年來多項研究證實，VEGF－C的高表達(dá)與胃癌［20］、乳腺癌［21］、甲狀腺癌［22］及子宮頸癌［23］的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Jeon［24］等通過建立人類卵巢癌小鼠模型探討其腹膜淋巴管特點及腹水形成過程，結(jié)果表明VEGF－C在卵巢癌淋巴管形成及重塑中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。Ueda［25］等研究表明，卵巢癌組織中VEGF－C的表達(dá)與腫瘤的臨床分期，腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及淋巴管生成顯著相關(guān)性。并且那些能夠同時產(chǎn)生VEGF－C和MMPs的腫瘤細(xì)胞，具有更加強(qiáng)大的降解EMC及侵入淋巴管的潛能，并最終導(dǎo)致在腫瘤的進(jìn)展和淋巴結(jié)的累犯。Li［26］等通過檢測卵巢癌的LVD、瘤內(nèi)淋巴管數(shù)目及淋巴管浸潤情況與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響卵巢癌患者疾病進(jìn)展的重要預(yù)后指標(biāo)和決定臨床治療策略的關(guān)鍵。本實驗中，D2－40標(biāo)記陽性的淋巴管在EOC組織癌巢周圍的間質(zhì)內(nèi)要明顯多于癌巢內(nèi)，且癌巢內(nèi)的淋巴管多成受壓、閉塞狀態(tài)。Jain［27］等認(rèn)為，腫瘤內(nèi)部的淋巴管由于受到周圍不斷分裂增殖的腫瘤細(xì)胞機(jī)械性的壓力作用，發(fā)生塌陷、萎縮，處于無功能狀態(tài)，或者由于腫瘤細(xì)胞已經(jīng)侵入并破壞了腫瘤巢團(tuán)內(nèi)部的淋巴管網(wǎng)，僅有少數(shù)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞殘余的結(jié)果。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著EOC的分化程度的降低、分期的進(jìn)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，VEGF－C的表達(dá)陽性率與LVD均顯著增加（P＜0.01）。同時，VEGF－C的表達(dá)分別與LVD及患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)正相關(guān)性（r分別為0.455，0.565，P均＜0.01）。本結(jié)果表明，VEGF－C可以通過促進(jìn)EOC患者淋巴管的形成進(jìn)而增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的形成。

實驗初步探討了EOC組織中 MMP－7、VEGF－C及D2－40的表達(dá)與其淋巴管形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。實驗結(jié)果提示，MMP－7、VEGF－C的表達(dá)在促進(jìn)EOC惡性進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中可能具有協(xié)同作用，聯(lián)合檢測 MMP－7、VEGF－C的表達(dá)和 D2－40標(biāo)記的LVD對卵巢癌高危病例的篩選、判斷其惡性程度以及評估患者預(yù)后都可能會有重要意義。

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