陳 冰 蘇祖蘭 朱曉群 陶香香 何 雷 王素芬

（1皖南醫(yī)學(xué)院病理教研室；2皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院病理科，安徽 蕪湖241001；3中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科，廣州 510630）

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）占非霍奇金淋巴瘤（non－Hodgkin＇s lymphomas，NHL）的30%－40%，是 NHL中最常見的一個(gè)亞型［1］。作為高異質(zhì)性疾病，其病情進(jìn)展快，預(yù)后差，但化療后約50%的患者可完全緩解，由于目前尚缺乏統(tǒng)一的組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其預(yù)后判斷較困難，尋找簡(jiǎn)單易行、經(jīng)濟(jì)可靠的方法進(jìn)行預(yù)后判斷成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。雖然DNA微陣列技術(shù)將其分為兩種類型［2］，但該技術(shù)由于成本高、對(duì)樣本要求新鮮等原因難以在臨床上推廣，而免疫組化技術(shù)由于操作簡(jiǎn)單、條件易控制、成本低已成為臨床必不可少的手段。選擇合適的指標(biāo)組建合理的方案進(jìn)行免疫組化檢測(cè)具有更實(shí)際的臨床意義。

MUM 1（multiple myeloma oncogene 1）是一種與骨髓瘤相關(guān)的癌基因，MUM1的癌基因功能最初于多發(fā)性骨髓瘤中被識(shí)別，主要表達(dá)于B細(xì)胞發(fā)育的后期和漿細(xì)胞［3］。泛素蛋白酶體通路參與了多種細(xì)胞過 程，泛 素 激 活 酶 （Ubiquitin－activating enzyme，UBE1）是泛素與底物蛋白結(jié)合所需的第一個(gè)酶。前期研究證實(shí)UBE1的表達(dá)在DLBCL的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用［4］。鑒于二者可能與DLBCL的侵襲及預(yù)后有關(guān)，我們收集80例彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤，非特殊型（DLBCL，NOS）標(biāo)本應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)其中MUM1、UBE1蛋白的表達(dá)，以進(jìn)一步探討MUM1及其與UBE1過表達(dá)在DLBCL預(yù)后判斷中的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

1.材料

收集皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院2007年10月－2010年12月外檢標(biāo)本中診斷明確的DLBCL，NOS 80例，其中男性49例，女性31例；年齡25－82歲，中位年齡60歲。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色，所有標(biāo)本的切片均經(jīng)2位以上病理專家重新閱讀。UBE1（編號(hào)AC0419）為濃縮型抗體，稀釋倍數(shù)為1∶200，購自ABGENT公司。MUM1（克隆號(hào) MUM1P）抗體類型為即用型、DAB顯色劑及EnVision二步法試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)公司。

2.方法

2.1 免疫組織化學(xué)EnVision二步法檢測(cè)

主要步驟：4μm的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高壓熱修復(fù)抗原處理后，冷卻至室溫，3%H2O2處理10min。PBS沖洗5min×3，滴加一抗放入4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗5min×3，滴加聚合物增強(qiáng)劑，37℃孵育箱孵育20min，PBS沖洗3min×3，滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，37℃孵育箱孵育30min，PBS沖洗5min×4。DAB鏡檢顯色3－5min，自來水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知的陽性片作為陽性對(duì)照。抗體陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞核染成棕黃色，以＞20%的腫瘤細(xì)胞染色判為陽性。

2.2 臨床相關(guān)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

體力狀況評(píng)分參照 Zubrod－ECOG－WHO（ZPS，5分法）標(biāo)準(zhǔn)分為0－5分；根據(jù)國(guó)際預(yù)后指數(shù)IPI分為低危（無或1個(gè)預(yù)后差因素）記為0－1分、低中危（2個(gè)預(yù)后差因素）記為2分、中高危（3個(gè)預(yù)后差因素）記為3分和高危（4個(gè)及4個(gè)以上預(yù)后差因素）記為4－5分。乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定采用自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行（速率法），高于250U/L判為升高。結(jié)外侵犯部位若為兩處及兩處以上則為＞1，否則為≤1。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

百分?jǐn)?shù)的比較用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)；Logistic回歸研究相關(guān)性；Kaplan－Meier生存分析方法比較患者生存率，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MUM1和UBE1在DLBCL患者中的表達(dá)及與臨床資料的相關(guān)性

80例DLBCL患者中MUM1表達(dá)的陽性率為62.5%（50/80），MUM1表達(dá)于細(xì)胞核，彌漫性分布，且著色深（圖1）；UBE1表達(dá)的陽性率為65.0%（52/80），UBE1主要表達(dá)于細(xì)胞核，少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞漿，表達(dá)的陽性細(xì)胞多為彌漫分布且核膜著色非常清晰，而且胞漿中也有較強(qiáng)的表達(dá)（圖2）。50例MUM1陽性標(biāo)本中32例同時(shí)表達(dá)UBE1，占其總數(shù)的64%（32/50）。將患者按年齡、體力狀況評(píng)分、Ann Arbor分期、LDH水平高低、結(jié)外侵犯部位數(shù)目及國(guó)際預(yù)后指數(shù)的危險(xiǎn)度分組，結(jié)果顯示MUM1及其與UBE1同時(shí)表達(dá)與患者的年齡、Ann Arbor分期、結(jié)外侵犯部位數(shù)目、LDH高低以及國(guó)際預(yù)后指數(shù)的危險(xiǎn)度相關(guān)（P＜0.05），而與性別、體力狀況評(píng)分無關(guān) （表1）。

圖1 MUM1蛋白在DLBCL中陽性表達(dá)EnVision法×400Fig.1 Positive expression of MUM1protein in DLBCL EnVision TM ×400

圖2 UBE1蛋白在DLBCL中陽性表達(dá)EnVision法×400Fig.2 Positive expression of UBE1protein in DLBCL EnVision TM ×400

表1 MUM1表達(dá)和UBE1同時(shí)表達(dá)與DLBCL臨床資料的相關(guān)性Table1 MUM1and UBE1expression and clinical significance of DLBCL associated

2.MUM1和UBE1蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

80例患者中58例可進(jìn)行預(yù)后分析，隨訪時(shí)間為2－36個(gè)月，中位隨訪時(shí)間28個(gè)月。58例中，死亡9例，其余49例仍在隨訪中。Kaplan—Meier生存分析顯示，MUM1表達(dá)的無病生存率顯著低于未表達(dá)的患者（分別為45.3%、73.7%），二者有顯著性差別（P＜0.05），但總體生存率（分別為70.6%、95.5%）二 者 差 異 無 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （P＞0.05）。MUM1與UBE1同時(shí)表達(dá)時(shí)患者的無病生存率和總體生存率（58.0%和67.7%）顯著低于其中MUM1未表達(dá)而UBE1表達(dá)的患者（無病生存率和總體生存率分別為86.9%和98.8%）（P＜0.05）。

討 論

DLBCL是成人淋巴瘤中最常見的一種類型。因其具有高度異質(zhì)性且沒有明確的組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)分，患者的預(yù)后難以預(yù)測(cè)。Hans等［2］應(yīng)用DNA微陣列技術(shù)根據(jù)CD10、Bcl－6及 MUM1將DLBCL分為 （germinal center B－cell－like，GCB）型 和 non－GCB型，GCB型的預(yù)后明顯好于non－GCB型，但因價(jià)格昂貴在臨床難以推廣。尋找簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的預(yù)測(cè)方法成為必然。隨著抗原技術(shù)的進(jìn)步、抗體的廣泛應(yīng)用、自動(dòng)免疫組化儀的普及，免疫組化技術(shù)成為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞起源最價(jià)廉物美的方法。目前DLBCL中，運(yùn)用較多的是CD10、Bcl－6及 MUM1的聯(lián)合檢測(cè)。但此方案中Bcl－6染色不穩(wěn)定，造成檢測(cè)結(jié)果解釋困難，因此尋找更合適的免疫組化方案預(yù)測(cè)DLBCL患者的預(yù)后成為眾多學(xué)者近年來研究的熱點(diǎn)［5］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇檢測(cè)MUM1和UBE1在DLBCL中的表達(dá)，以尋找更確切、更經(jīng)濟(jì)的免疫組化方案來預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。

轉(zhuǎn)錄因子 MUM1，又稱為L(zhǎng)SIRF（lymphoid specific IRF），是一種與骨髓瘤相關(guān)的癌基因，是干擾素調(diào)節(jié)因子家族的新成員，在細(xì)胞的增殖、分化和生存方面中起重要作用。其異常表達(dá)是由于t（6；14）（p25；q32）染色體易位，易位的結(jié)果導(dǎo)致 MUM1蛋白過表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的形成［6］。因 MUM1單獨(dú)作為預(yù)后因素尚有爭(zhēng)議［7］，由此我們?cè)O(shè)想MUM1是否能和前期研究的其它指標(biāo)結(jié)合起來組建新的免疫組化方案用于DLBCL患者預(yù)后的預(yù)測(cè)。

泛素激活酶UBE1其編碼基因定位于人類染色體Xp11.23，是泛素與底物蛋白結(jié)合所需的激活酶。泛素蛋白酶體降解障礙將導(dǎo)致腫瘤的癌基因的增加和抑癌基因的減少，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)很多癌基因和抑癌基因蛋白酶體降解的靶點(diǎn)［8］。研究表明UBE1參與某些半衰期較短的mRNA如一些腫瘤抑制基因、細(xì)胞因子等的mRNA的選擇性滅活，通過這種選擇性滅活，UBE1調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的基因表達(dá)以維持各種復(fù)雜生理功能之間的協(xié)調(diào)與平衡［9］。本課題組在前期，應(yīng)用自行設(shè)計(jì)的cDNA芯片在mRNA水平篩選出NHL中10個(gè)差異表達(dá)基因，其中UBE1表現(xiàn)顯著上調(diào)。并在此基礎(chǔ)上采用免疫組化法檢測(cè)了49例DLBCL患者UBE1的表達(dá)，總陽性表達(dá)率為65.3%，檢測(cè)到 UBE1在DLBCL和RH中表達(dá)的陽性率具有顯著性差異（P＜0.05），可能在DLBCL發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用［4］。值得注意的是，其中UBE1的表達(dá)陽性率較高，且染色較深，易于辯認(rèn)，因此設(shè)想其是否可作為DLBCL預(yù)后判斷免疫組化方案中的新成員，同時(shí)查閱文獻(xiàn)，聯(lián)合檢測(cè)MUM1和UBE1的表達(dá)亦未見相關(guān)報(bào)道。

通過對(duì)80例DLBCL，NOS標(biāo)本采用免疫組化（EnVision二步法）技術(shù)進(jìn)行了MUM1和UBE1的檢測(cè)，結(jié)果表明UBE1表達(dá)的陽性率較高（65.0%），與前期研究一致［4］，UBE1表達(dá)陽性細(xì)胞多為彌漫分布且核膜著色非常清晰，呈棕色的陽性反應(yīng)，顯微鏡下易于辯認(rèn)；MUM1表達(dá)的陽性率也較高，為62.5%，和國(guó)內(nèi)外報(bào)道的DLBCL患者中有50%－77%MUM1表達(dá)的結(jié)果相一致［10］，MUM1主要在核表達(dá)，著色也較深，經(jīng)復(fù)染后，棕藍(lán)色對(duì)比顯著，且無明顯的背景著色，這一結(jié)果顯示，其與UBE1的表達(dá)在鏡檢時(shí)都易判斷結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)將MUM1、UBE1均陽性表達(dá)患者的臨床資料進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與性別、體力狀況評(píng)分無關(guān)，主要表達(dá)于年齡≥60歲、LDH升高、Ann Arbor分期Ⅲ/Ⅳ、結(jié)外侵犯部位＞1處、以及國(guó)際預(yù)后指數(shù)中的中高危和高危的患者，應(yīng)用Kaplan—Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)MUM1在DLBCL中高表達(dá)提示預(yù)后不良，特別是在同時(shí)出現(xiàn)UBE1高表達(dá)時(shí)更顯著，提示MUM1表達(dá)和UBE1同時(shí)表達(dá)可能在預(yù)后方面有重要價(jià)值，為組建易判斷、穩(wěn)定的免疫組化方案提供了重要參考。

MUM1的高表達(dá)可能與其在腫瘤細(xì)胞中的激活能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)MUM1和c－myc關(guān)系密切。MUM1激活c－myc，c－myc又反激活MUM1，隨后激活MUM1依賴性的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因網(wǎng)絡(luò)［11］。正常細(xì)胞中c－myc原癌基因一旦被異常激活為癌基因，c－myc mRNA和c－Myc蛋白表達(dá)異常增高，活化轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞脫離正常生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的限制而處于高度增生狀態(tài)，將開始向惡性表型轉(zhuǎn)化；同時(shí)c－myc的高水平表達(dá)還抑制細(xì)胞的分化，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用也遭到破壞而參與到腫瘤形成機(jī)制中；c－myc表達(dá)失控還是許多癌癥發(fā)生和腫瘤治療效果不明顯的主要原因之一［12］。因此，MUM1可能是通過與c－myc的相互作用參與到腫瘤細(xì)胞的增殖中，進(jìn)而造成患者的預(yù)后及療效差。

MUM1與UBE1同時(shí)高表達(dá)，我們推測(cè)可能是因?yàn)樵谀[瘤的后期，MUM1促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，且癌基因大量出現(xiàn)要求泛素蛋白酶體降解功能亢進(jìn)，但此時(shí)癌基因生成的速度遠(yuǎn)超過泛素蛋白酶體的降解速度，以至于表達(dá)失控，成為DLBCL后期治療效果及預(yù)后更差的主要原因，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，DLBCL中MUM1和UBE1表達(dá)的陽性率均較高，陽性定位佳，彌漫分布，無明顯背景著色，具有表達(dá)特異性強(qiáng)、易診斷等優(yōu)點(diǎn)，選擇檢測(cè)MUM1和UBE1蛋白表達(dá)水平的高低可能有助于更精確判斷DLBCL的預(yù)后，對(duì)臨床制定更合理的治療方案，具有重要的意義。

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