劉 偉 馬東林 劉文文 俞 豪 王宇童

（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

非酒精性脂肪性肝病（non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是以無過量飲酒史病人的肝細(xì)胞發(fā) 生 脂 肪 性 變 為 病 理 特 征 的 臨 床 綜 合 癥［1，2］。NALFD的臨床癥狀主要有脂肪變性、肝小葉出現(xiàn)不同程度的炎癥、氣球樣變及纖維化，非酒精性脂肪性肝炎（non－alcoholic steatohepatitis，NASH）是其中的一種病理分型。NASH是單純性脂肪肝向肝纖維化、肝硬化進(jìn)展的重要中間環(huán)節(jié)［3］。據(jù)報(bào)道NAFLD在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率成人約為30%，兒童約為13%。而在肥胖或糖尿病患者中發(fā)病率約為80%。大約10%的NALFD病人會(huì)發(fā)展為NASH，而這些NASH病人中約有20%在10年內(nèi)會(huì)發(fā)展成為肝硬化［4］。由此可見，NASH已成為目前備受重視的臨床綜合癥之一。NASH的發(fā)病機(jī)制暫不明確，目前國際上比較公認(rèn)的機(jī)制為“二次打擊學(xué)說”。所謂的“第一次打擊”是指游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）和甘油三酯（triglyceride，TG）在肝細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，使肝細(xì)胞發(fā)生脂肪性變，影響細(xì)胞的生理和生化功能。這種“第一次打擊”幾乎在所有代謝綜合征患者中出現(xiàn)［5］。變性的肝細(xì)胞在受到外界的刺激，例如氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子刺激等，很容易引發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死。這些外界刺激所造成的肝細(xì)胞損傷統(tǒng)稱為“二次打擊”［6］。研究結(jié)果表明，沉積在細(xì)胞內(nèi)的FFA主要集中在線粒體、微粒體和過氧化酶體等細(xì)胞器，它們不僅作為“第一次打擊”使肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，而且在它們發(fā)生過氧化反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生的超氧離子及自由基會(huì)對肝細(xì)胞造成“第二次打擊”［7］。

眾所周知，膽固醇（cholesterol，Chol）和磷脂等脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程主要在肝臟完成。而在經(jīng)典的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，載脂蛋白A－1（apolipoprotein A－I，apoA－I）起到非常重要的作用。apoA－I是由243個(gè)氨基酸編碼而成的蛋白質(zhì)，在肝細(xì)胞合成，分泌到肝細(xì)胞外［8］，而 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子 （ATP－binding cassette transporter A1，ABCA1）則負(fù)責(zé)將肝細(xì)胞內(nèi)的膽固醇和磷脂接到轉(zhuǎn)運(yùn)到乏脂的apoAI上。這些部分脂質(zhì)化的apoA－I可以在外周細(xì)胞中接收更多通過ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)的膽固醇和磷脂，形成高密度脂蛋白（HDL），并回到肝臟，經(jīng)過進(jìn)一步加工代謝，最終以膽汁的方式排出體外［9］。國內(nèi)外對于apoA－I的研究主要是在動(dòng)脈粥樣硬化中。例如最近的研究表明，apoA－I的糖基化與二型糖尿病人的動(dòng)脈斑塊進(jìn)展有關(guān)［10］。但是在NASH的領(lǐng)域中，apoA－I的研究卻處于空白。越來越多的證據(jù)表明，二型糖尿病患者所伴隨高血糖和脂質(zhì)代謝失調(diào)是引發(fā)NASH的重要原因［11］；無論是一型糖尿病患者還是二型糖尿病患者，他們體內(nèi)的FFA都會(huì)增高，并且二型糖尿病患者在代謝失調(diào)的另一個(gè)危險(xiǎn)因素是HDL降低［12］。這些均提示FFA有可能直接參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程，從而影響糖尿病病人血脂水平，也有可能在NASH過程中，對于FFA也起到類似的作用。所以研究FFA，apoA－I及NASH之間的關(guān)系就有著非常重大的意義。

研究apoA－I在 NASH 中的治療作用，選擇NASH動(dòng)物模型很重要。目前的動(dòng)物模型主要為三種：①基因敲除或基因突變模型；②營養(yǎng)、藥物或毒物誘發(fā)模型；③復(fù)合模型（聯(lián)合應(yīng)用基因模型和營養(yǎng)模型）［13］。由于很少的NASH病人是遺傳基因缺陷的先天原因造成，因此飲食引起的NASH動(dòng)物模型和人類的NASH有很大的相關(guān)性。飲食造成的NASH動(dòng)物模型也有很多，各自都有優(yōu)缺點(diǎn)：如普通高脂飼料主要的病理特征和NASH病人很相似，但是飼養(yǎng)周期長［14］；蛋氨酸膽堿缺乏飲食（methionine and choline－deficient，MCD）飼養(yǎng)周期短，造?？?，但是動(dòng)物往往無肥胖，高膽固醇以及胰島素抵抗等并發(fā)癥［15］。由此可見，MCD可作為研究NASH的良好模型。本研究旨在探索在MCD構(gòu)建的NASH小鼠模型中過量表達(dá)apoA－I對于肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響。

材料和方法

1.材料

小鼠抗甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗體（上?？党缴镉邢薰荆?；小鼠抗apoA－I抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Western blotting超敏化學(xué)發(fā)光液、游離脂肪酸超敏測定試劑盒、組織細(xì)胞總膽固醇酶法測定試劑盒、三酰甘油測定試劑盒（北京蒂諾奧基因技術(shù)有限公司）；對照腺病毒 （ad－Null）、apoA－I腺病毒（adapoA－I）購于北京諾賽基因組研究中心有限公司；6－8周齡C57/BL6雄性小鼠，體重20－25g（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物部）；MCD飼料參考國外文獻(xiàn)配方［16］并由北京華阜康有限公司制作；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.模型制備及分組

20只C57/BL6雄性小鼠飼喂普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成正常飼料組對照組（control）、MCD飼料組（MCD）、MCD＋對照腺病毒組（MCD＋Null）和 MCD＋apoA－I腺病毒組（MCD＋apoAI）4組，每組5只。MCD＋Null組小鼠以1×108PU/只的劑量通過股靜脈注射ad－Null，MCD＋apoA－I以1×108PU/只的劑量通過股靜脈注射腺病毒ad－apoA－I，注射病毒24h后，飼喂 MCD飼料。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝食、飲水。

3.取材

兩周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小鼠禁食水12h后，稱重；4%水合氯醛麻醉；下腔靜脈取血，分離血清。－80℃保存；肝臟稱重后部分液氮凍存，部分4%多聚甲醛固定。

4.指標(biāo)檢測

4.1 一般情況

觀察各組小鼠行為活動(dòng)、形體狀態(tài)、毛發(fā)，飲食及死亡情況，稱取體重和肝臟濕重，計(jì)算肝臟指數(shù)〔肝指數(shù)（%）＝肝臟重量（g）/體重（g）×100%〕。

4.2 肝組織病理學(xué)檢測

取小鼠肝組織制作冰凍切片，進(jìn)行油紅O染色；同時(shí)制作肝組織石蠟切片，進(jìn)行H＆E染色。在光鏡下分別觀察油紅O染色切片機(jī)H＆E染色切片，并對肝臟脂肪變性和炎癥情況進(jìn)行評(píng)估。病理學(xué)診斷采用由美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)絡(luò)病理委員會(huì)2005年所定的指南［17］，根據(jù)其制定的NAFLD活動(dòng)度積分（NAFLD Activity Score，NAS）進(jìn)行評(píng)估。NAS組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)對14項(xiàng)病理改變，3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了半定量評(píng)估計(jì)分：肝脂肪變（按發(fā)生脂肪變性實(shí)質(zhì)細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)，＜5%、5%－33%、33%－66%、＞66%，分別計(jì)0－3分）、小葉內(nèi)炎癥（按無病灶、＜2、2－4、＞4，分別計(jì)0－3分）、肝細(xì)胞氣球樣變（按無、少量氣球樣細(xì)胞、較多/顯著氣球樣變，分別計(jì)0－2分），其中NAS≥5分者可明確NASH的診斷，NAS＜3分則可排除NASH，兩者之間者為NASH可能。油紅O及H＆E切片使用Leica攝像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和攝片。

4.3 血清學(xué)檢測

通過下腔靜脈取血獲取血清，保存于－80℃冰箱中。采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST），TG和Chol。

4.4 肝組織TG，F(xiàn)FA，Chol含量測定

精確稱取0.5mg肝組織，按照三酰甘油酶法測定試劑盒、游離脂肪酸超敏測定試劑盒以及組織總膽固醇酶法測定試劑盒說明書中針對組織提取脂質(zhì)的方法研磨萃取脂質(zhì)，隨后按照說明書操作，得到相應(yīng)的OD值，依標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到組織內(nèi)三酰甘油、游離脂肪酸以及總膽固醇的濃度，結(jié)果以mmol/L表示。

5.Western blot

取0.5mg肝組織，用RIPA裂解液裂解提取總蛋白，用BCA定量法測定樣品濃度。取適量樣品進(jìn)行SDS－PAGE。樣品在濃縮膠恒壓80V電泳，進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)制120V，電泳1h。電泳后將膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，通過Bio Rad mini－ProteinⅡ電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國Bio Rad公司）進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)后PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉在室溫封閉1h，而后加入相應(yīng)稀釋的一抗，4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，稀釋后的二抗（1∶5000）室溫孵育1h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，于暗室內(nèi)化學(xué)發(fā)光液孵育后對X光片曝光。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件分析，組間比較采用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.構(gòu)建的ad－apoA－I腺病毒在肝臟中過量表達(dá)apoA－I蛋白

注射ad－Null腺病毒或ad－apoA－I腺病毒2w后提取小鼠肝組織蛋白進(jìn)行apoA－I蛋白 Western blot檢測顯示，與注射ad－Null腺病毒的小鼠肝臟組織比較，在注射ad－apoA－I腺病毒的小鼠肝臟中可apoA－I蛋白表達(dá)水平明顯增高（圖1）。

圖1 ad－apoA－I腺病毒注射對小鼠肝內(nèi)apoA－I蛋白質(zhì)水平影響的 Western blot檢測.＊P＜0.05Fig.1 Western blot detection of effect of ad－apoA－I virus injection on apoA－I level in the MCD diet－mouse liver.＊P＜0.05

2.過表達(dá)apoA－I減輕由MCD飼喂所引起的小鼠體重下降及小鼠肝臟指數(shù)下降

飼養(yǎng)過程中各組小鼠均無死亡，對照組小鼠體毛整齊有光澤，體重正常，且穩(wěn)步增長，活動(dòng)度正常，精神良好，進(jìn)食正常，墊料干燥。與對照組相比，MCD組及MCD＋Null組小鼠的體毛凌亂、無光澤，體重減輕，活動(dòng)減弱，精神萎靡，進(jìn)食量明顯下降，進(jìn)水量上升，墊料潮濕；而MCD＋apoA－I組小鼠體活動(dòng)度尚可，精神較好，進(jìn)食量無明顯下降，進(jìn)水量微有上升，墊料稍微潮濕。比較各組小鼠體重、肝濕重和肝臟指數(shù)可以看出，MCD組比對照組小鼠體重下降明顯，而 MCD＋apoA－I組體重明顯大于 MCD組及MCD＋Null組（圖2A）；MCD組小鼠肝濕重較對照組明顯下降，MCD＋apoA－I組肝濕重較MCD組和MCD＋Null組明顯增加（圖2B）；MCD組肝臟指數(shù)較對照組顯著下降，MCD＋apoA－I組肝臟指數(shù)較MCD組和MCD＋Null組明顯增加（圖2C）。

圖2 每組小鼠的體重、肝濕重和肝臟指數(shù)比較。A，體重；B，肝濕重；C，肝臟指數(shù)。＊P＜0.05。Fig.2 Comparision of body weight，liver wet weight and hepatic index of mice in each group.A，body weight；B，liver wet weight；C，hepatic index.＊P＜0.05.

3.過表達(dá)apoA－I改善由MCD飼喂所引起的小鼠肝臟病理學(xué)變化

H＆E染色顯示，對照組小鼠肝組織肝竇清晰可見，肝索排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常（圖3Aa）；MCD組小鼠及MCD＋Null組肝細(xì)胞內(nèi)充滿大量大小不一的脂肪空泡，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂呈氣球樣變，多數(shù)細(xì)胞脂肪化發(fā)生，肝小葉內(nèi)多淋巴結(jié)細(xì)胞浸潤（圖3Ab和圖3Ac）；MCD＋apoA－I組小鼠肝組織部分肝細(xì)胞內(nèi)存在脂肪空泡，與MCD組比較脂肪空泡明顯減少，少部分區(qū)域出現(xiàn)肝索結(jié)構(gòu)紊亂，偶見炎性細(xì)胞浸潤（圖3Ad）。

油紅O染色顯示，對照組小鼠肝組織未見紅色脂滴（圖3Ae）；MCD組及MCD＋Null組小鼠肝組織可見大量紅色脂滴，部分融合成片，表現(xiàn)為脂滴彌漫浸潤入肝細(xì)胞中，肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)約為45－60%（圖3Af和圖3Ag）；MCD＋apoA－I組小鼠肝組織可見局部散在紅色脂滴，成小顆粒狀，肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)約為0－10%（圖3Ah）。

肝組織病理評(píng)分顯示，MCD組肝組織評(píng)分較對照組顯著升高，總分＞5分，符合NASH組織學(xué)診斷，表明模型復(fù)制成功；MCD＋Null組病理評(píng)分略低于MCD組，而MCD＋apoA－I組顯著低于 MCD＋Null組（圖3B）。

圖3 過表達(dá)apoA－I對由MCD飼喂所引起的小鼠肝臟病理損害的影響。A，肝臟病理學(xué)的H＆E染色（HE）和油紅O染色（Oil Red）；a和e，對照組；b和f，MCD組；c和g，MCD＋Null組；d和h，MCD＋apoA－I組；B，病理評(píng)分分析。Fig.3 Effect of apoA－I overexpression on pathological impairment in MCD diet－mouse liver.A，H＆E and Oil Red O staining of mouse liver pathology；a and e，control group；b and f，MCD group；c and g，MCD＋Null group；d and h，MCD＋apoA－I group；B，Histogram of pathological score of liver.

4.過表達(dá)apoA－I抑制由MCD飼喂所引起的血清ALT、AST濃度升高和Chol、TG濃度降低

ALT、AST是反應(yīng)肝臟功能的重要指標(biāo)，apoAI作為一種載脂蛋白，對肝臟脂質(zhì)變化具有重要影響，于是，我們檢測了血清中的ALT、AST、TG和Chol水平。結(jié)果顯示，血清ALT和AST濃度在MCD組和 MCD＋Null組較對照組顯著上升，在MCD＋apoA－I組較對照組略有升高，但明顯低于MCD組和 MCD＋Null組（圖4A和圖4B）；血清TG和Chol濃度在MCD組和MCD＋Null組較對照組顯著降低，在 MCD＋apoA－I組較 MCD組和MCD＋Null組明顯升高（圖4C和圖4D）。

圖4 過表達(dá)apoA－I對由MCD飼喂所引起的血清ALT、AST、Chol和TG水平改變的影響。＊P＜0.05。Fig.4 Effect of apoA－I overexpression on the change of serum level of ALT，AST，Chol and TG in MCD diet－mouse.＊P＜0.05.

5.過表達(dá)apoA－I抑制由MCD飼喂所引起的肝組織TG、Chol、FFA堆積

對小鼠肝組織中脂質(zhì)存留量的檢測顯示，飼喂MCD飼料后，MCD組小鼠肝組織中的TG、Chol及FFA的含量相對于對照組均有不同程度的升高，而過表達(dá)apoA－I小鼠肝組織中的TG、Chol及FFA的含量相對于MCD＋Null組有顯著降低（圖5）。

圖5 過表達(dá)apoA－I對由MCD飼喂所引起的肝組織TG、Chol、FFA堆積的影響。＊P＜0.05。Fig.5 Effect of apoA－I overexpression on accumulation of TG，Chol and FFA in MCD diet－mouse liver.＊P＜0.05.

討 論

MCD飼料飼喂誘導(dǎo)的動(dòng)物模型是國際上公認(rèn)的研究NAFLD中炎癥及纖維化的最好的動(dòng)物模型之一［15］。MCD飼喂小鼠后，小鼠肝組織會(huì)發(fā)生進(jìn)展性脂肪性病變，并進(jìn)一步發(fā)展為纖維化，并伴有無胰島素抵抗，無肥胖，無血脂異常，血清學(xué)TG水平降低，體重下降明顯，肝重及肝指數(shù)下降［18］。本實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)中，MCD組小鼠體重、肝重及肝指數(shù)均下降，與該模型的描述相符。H＆E染色及油紅O染色中獲得的病理評(píng)分及血清學(xué)ALT、AST水平進(jìn)一步說明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了MCD飼料飼喂的小鼠NASH模型。

我們的實(shí)驗(yàn)表明，apoA－I腺病毒載體注入小鼠體內(nèi)后，可以穩(wěn)定持續(xù)地表達(dá)目的蛋白。由H＆E和油紅O結(jié)果可以看出，過表達(dá)apoA－I可以有效地抑制脂質(zhì)在肝臟中的沉積，從而減輕肝臟的病變，ALT和AST均有不同程度的降低，這證明apoA－I對小鼠肝臟功能具有一定的保護(hù)作用。apoA－I可以降低肝臟組織中TG，Chol及FFA的含量，與此同時(shí)，血清中TG與Chol的含量有所升高。由此表明，apoA－I可以通過將肝細(xì)胞內(nèi)的過量脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，進(jìn)入血清中，從而減少肝臟內(nèi)的過量脂質(zhì)沉積，降低脂質(zhì)對肝細(xì)胞的“第一次打擊”，這也從根源上減緩了NASH的進(jìn)程，起到有效的治療作用。在肝細(xì)胞的脂質(zhì)堆積中，危害作用最大的是高濃度的FFA。長期高脂飲食使FFA攝入增加、胰島素抵抗增加、肝細(xì)胞線粒體脂肪酸β氧化減少，以上因素都會(huì)造成肝臟和血清中FFA增加。FFA與NASH的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系，與疾病的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［19，20］。而抑制FFA能夠提高肝細(xì)胞對胰島素的敏感性，降低肝生化酶活性［19，21］。所 以 apoA－I可以通過其降低FFA濃度的作用，有效地預(yù)防和改善NASH。

綜上所述，apoA－I在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)后，可以通過將肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，進(jìn)入血清，從而減少脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)的蓄積，減少脂質(zhì)氧化反應(yīng)原料，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終對NASH起到防治的作用。而在此過程中，apoA－I是否對于脂質(zhì)代謝中的酶（如抗氧化酶SOD、GSH－PX等）具有調(diào)節(jié)作用，仍有待進(jìn)一步研究。

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