孫全新 孫小蓉 吳文竹

（武漢市中山醫(yī)院腫瘤科 湖北430033；1武漢市東湖醫(yī)院 湖北430074）

宮頸癌是由高危型HPV病毒持續(xù)感染所致。HPV病毒可整合到宮頸細(xì)胞DNA中，通過(guò)病毒E6或E7蛋白影響p Rb或P53通道［1］，引起宮頸細(xì)胞核內(nèi)染色體倍體改變，例如HPV16型病毒可致細(xì)胞核內(nèi)染色體3q增多，最終可致宮頸癌［2－3］。最近，很多研究測(cè)定宮頸細(xì)胞內(nèi)Ki67和P16蛋白，用于檢驗(yàn)高危型HPV感染引起宮頸細(xì)胞異常增生［4－5］。Ki67蛋白表示細(xì)胞正在增生狀態(tài)［6］，而P16蛋白表示為高危型 HPV感染［7］。很少有人研究Ki67和P16雙陽(yáng)性細(xì)胞是否出現(xiàn)在異倍體細(xì)胞，本文試圖用圖像分析儀結(jié)合Ki67和P16免疫熒光方法，證實(shí)同一個(gè)異倍體細(xì)胞內(nèi)Ki67和P16的表達(dá)。

材料和方法

1.標(biāo)本來(lái)源

2012年3月，8例婦女（37±6歲）做宮頸細(xì)胞學(xué)檢查和宮頸組織學(xué)活檢。宮頸細(xì)胞檢查試劑盒由武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司提供，其中包括：宮頸刷、盛有固定液的標(biāo)本管、標(biāo)簽等。

2.宮頸細(xì)胞液基薄層制片及染色

取樣方法按常規(guī)方法進(jìn)行取材。用于液基薄層制片試劑盒由武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司提供，其制片染色方法按常規(guī)方法進(jìn)行。DABI試劑來(lái)自于武漢博士德公司，單克隆Ki67和單克隆P16抗體來(lái)自于上海上島生物工程科技公司，分別用熒光FITC和TRITC標(biāo)記的二抗。Ki67陽(yáng)性為核內(nèi)綠色，而P16陽(yáng)性為核胞漿紅色。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

3.DNA倍體分析方法

所有DABI染色片采用蘭丁全自動(dòng)細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描處理（武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司）。該系統(tǒng)用OLYMPUS熒光顯微鏡在紫外光下對(duì)每張玻片中1000個(gè)以上的細(xì)胞核進(jìn)行掃描測(cè)定細(xì)胞核為淺藍(lán)色。經(jīng)掃描后的每個(gè)細(xì)胞核均有77個(gè)特征值，其中包括形態(tài)特征、吸光特征、具體結(jié)構(gòu)特征等。系統(tǒng)根據(jù)不同細(xì)胞成分所具有的不同特征參數(shù)來(lái)完成自動(dòng)細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)過(guò)程。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照細(xì)胞為同張玻片上的100個(gè)正常上皮細(xì)胞，所測(cè)出的平均光密度（Integrated Optical Density IOD）為2c的參考值，其CV（Coefficient of Variation）值小于5% 。凡是有大于5c以上非整倍體細(xì)胞，都要通過(guò)細(xì)胞技術(shù)員在顯微鏡下逐一對(duì)大于5c細(xì)胞進(jìn)行核實(shí)。

4.組織病理學(xué)檢查

在8例宮頸活檢中發(fā)現(xiàn)2例宮頸炎，1例CIN1，2例CIN2，2例CIN3和一例宮頸浸潤(rùn)癌。CIN2，CIN3和浸潤(rùn)癌為高級(jí)別宮頸病變，宮頸炎和CIN1為低級(jí)別宮頸病變。

結(jié) 果

1.細(xì)胞周期內(nèi)DNA倍體變化和Ki67表達(dá)

在8例宮頸細(xì)胞樣本中除第5例，第7例和第8例外，S期內(nèi)只有少數(shù)細(xì)胞。每例均可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)在G2期。S期和G2期Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)約占S－G2期91%左右。每例樣本上皮細(xì)胞大多處于G0／G1期，Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均≤1.5%。

2.異倍體細(xì)胞內(nèi)DNA倍體，Ki67和P16表達(dá)

2例宮頸炎的細(xì)胞樣本中均未見(jiàn)＞5c的異倍體細(xì)胞。1例CIN1標(biāo)本中有4個(gè)＞5c的異倍體的細(xì)胞數(shù)，但Ki67和P16均陰性。后五例包括2例CIN2，2例CIN3和1例浸潤(rùn)癌，均可見(jiàn)＞5c的異倍體細(xì)胞，5例中＞5c的異倍體細(xì)胞總數(shù)為55，其中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞為38，占69%（38／55）；P16只在3例中有表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為12，占＞5c的異倍體細(xì)胞的21.8%（12／55）；Ki67和P16共同陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為10個(gè)，占＞5c的異倍體細(xì)胞的18.2%。P16陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的31.6%（12／38），表1、圖1和圖2。

表1 8例宮頸細(xì)胞中異倍體細(xì)胞及其Ki67和P16陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Table 1 Number of aneuploid cells，ki67 positive and p16 positive cells in 8 cervical cases

討 論

1.異倍體細(xì)胞Ki67和P16蛋白表達(dá)

很多作者用流式細(xì)胞儀測(cè)定異倍體細(xì)胞Ki67蛋白表達(dá)。本文通過(guò)DABI熒光染色宮頸細(xì)胞測(cè)定其細(xì)胞核內(nèi)倍體狀態(tài)，再通過(guò)Ki67和P16免疫熒光著色細(xì)胞，通過(guò)三種不同激發(fā)光分別測(cè)定同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量、Ki67和P16蛋白表達(dá)。若異倍體細(xì)胞有Ki67和P16陽(yáng)性，分別提示此宮頸細(xì)胞被HPV病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)染色體倍數(shù)改變和細(xì)胞呈現(xiàn)增殖狀態(tài)。異倍體細(xì)胞若Ki67表達(dá)陰性，雖無(wú)詳細(xì)報(bào)道，是否說(shuō)明異倍體細(xì)胞呈現(xiàn)在靜止?fàn)顟B(tài)。異倍體細(xì)胞P16蛋白表達(dá)陰性或許說(shuō)明這類異倍體細(xì)胞的產(chǎn)生與高危型HPV無(wú)關(guān)。

2.異倍體細(xì)胞Ki67陽(yáng)性表示細(xì)胞正在處于增殖周期中

Ki67是細(xì)胞進(jìn)行增殖周期時(shí)的蛋白表達(dá)，表示細(xì)胞正處于細(xì)胞有絲分裂狀態(tài)，在正常細(xì)胞分裂周期中，除G0期外，G1、S1、G2期細(xì)胞核內(nèi)均可見(jiàn)Ki67蛋白表達(dá)。G0／G1和G2期細(xì)胞DNA倍體分別為2c和4c；S期DNA倍體在2c與4c之間。本文所示＞5c的異倍體細(xì)胞均在正常細(xì)胞周期之外，說(shuō)明細(xì)胞DNA倍體已經(jīng)發(fā)生異常改變。異倍體細(xì)胞如何進(jìn)行增殖仍不清楚。但當(dāng)異倍體細(xì)胞中出現(xiàn)Ki67蛋白陽(yáng)性時(shí)，表示異倍體細(xì)胞正在增生分裂狀態(tài)。本文中69%的異倍體細(xì)胞Ki67陽(yáng)性，說(shuō)明這些宮頸細(xì)胞正在增殖發(fā)展中。

3.異倍體細(xì)胞內(nèi)Ki67和P16陽(yáng)性表達(dá)提示病變嚴(yán)重程度

異倍體細(xì)胞中P16陽(yáng)性表示這些異倍體細(xì)胞是由HPV病毒感染所致。P16INK4a是cyclin－dependent kinaze（CDK）抑制因子，它可減慢細(xì)胞增殖速度。HPV整合到人類基因后可產(chǎn)生E6，E7病毒蛋白。E7 HPV蛋白可促使retinolastoma protein（p Rb）和E2F形成復(fù)合體。E2F增多可增強(qiáng)P16INK4a活性及表達(dá)［8］。有研究證實(shí)80%以上高級(jí)別宮頸病變（CIN2，CIN3和浸潤(rùn)癌）的宮頸組織中P16蛋白的表達(dá)陽(yáng)性而宮頸炎和CIN1病變的陽(yáng)性表達(dá)率不到31%。同時(shí)P16蛋白的表達(dá)提示高危型HPV感染及宮頸病變的嚴(yán)重階段［6］。本文證實(shí)在5例CIN2以上病變中有3例P16為陽(yáng)性。以往很少有人證實(shí)Ki67和P16蛋白在同一細(xì)胞中表達(dá)。本文證實(shí)在＞5c異倍體細(xì)胞中有18.2%細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)Ki67和P16。

總之，宮頸異倍體細(xì)胞中大多為Ki67表達(dá)陽(yáng)性，說(shuō)明異倍體細(xì)胞呈增生狀態(tài)。少數(shù)異倍細(xì)胞呈現(xiàn)Ki67和P16共同陽(yáng)性，說(shuō)明這些細(xì)胞是由HPV病毒引起的細(xì)胞染色體的異常，病變正往惡性方向發(fā)展。

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