孔宏亮 苗志林 李占全 葉麗萍

（遼寧省人民醫(yī)院心臟中心 沈陽110016）

阿霉素（adriamycin，Adr）的高效、廣譜抗腫瘤特性使其被廣泛應用于治療多種惡性腫瘤，不過，其導致不可逆心肌病、心力衰竭（heart failure，HF）的心臟毒性卻嚴重限制其在臨床上的應用，并因此成為HF模型構建的經(jīng)典方法之一。目前認為細胞凋亡在Adr心肌毒性中發(fā)揮重要作用，可能涉及線粒體途徑、Fas途徑、PI3K／Akt途徑、神經(jīng)酰胺信號系統(tǒng)、P38MAPK途徑、P53途徑、P35途徑和GATA－4途徑等的相互作用［1，2］。具有內(nèi)源性整合調(diào)控機制的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在適度表達時可調(diào)節(jié)細胞自穩(wěn)態(tài)而抑制凋亡，但持續(xù)過度的 ERS卻觸發(fā)細胞凋亡［3－5］。

在 ERS 中，肌 醇 依 賴 酶 1（inositol－requiring enzyme，IRE 1）通路起著重要作［5－7］，在IRE1啟動細胞凋亡中，最顯著的就是c－Jun N末端激酶（JNK）途徑［5－7］：IRE1 激 活 后，通 過 TNF 受 體 相 關 因 子 2（tumor necrosis factor receptor－associated receptor 2，TRAF2）－凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal－regulating kinase 1，ASK1）－c－Jun N末端激酶（c－Jun N－termianl kinase，JNK）途徑激活JNK，誘導細胞凋亡。目前，對于Adr致心肌損傷效應中，ERS所發(fā)揮的作用罕見報道，更遑論Adr對IRE1－TRAF2－ASK1－JNK通路的影響。

材料和方法

1.動物和試劑

Wistar大鼠（150－200g）和乳鼠（1－3d）源自中國醫(yī)科大學動物中心［SCXK（遼）2003－0009］。試劑：阿霉素（adriamycin，Adr；Sigma公司），總Rt－PCR提取試劑盒、Rt－PCR逆轉錄試劑盒和Rt－PCR引物（武漢博士德生物技術公司），F(xiàn)CM試劑盒（Sigma），即用型兔抗大鼠IRE、X盒結合蛋白1（X box－binding protein l，XBP l）、TRAF2、ASK1、JNK1／2和 GAPDH 兔抗鼠多克隆抗體及羊抗兔Ig G等（寶生物工程大連有限公司）等。

2.Adr構建HF模型

參照文獻 構 建 HF 模 型［3，4，9］，方 法 如 下：隨 機取健康大鼠分為Adr組 （n＝15）和對照組（control group，n＝10）；Adr組腹部注射 Adr（2 mg／kg），每三天一次共連續(xù)五次，之后每周一次共五次，停用2周后心臟超聲檢查確認HF模型成功構建；對照組按Adr注射方法注射等量生理鹽水。所有大鼠均常規(guī)喂養(yǎng)。

3.心臟超聲檢查

按下述方法對大鼠行心臟超聲檢查［1，2，8］：腹部注射10%水合氯醛 （0.3－0.4mg／l00g）15－20min后仰臥位固定，重復3次測定左室射血分數(shù)（LVEF）并取其均值，LVEF＜45%被作為HF標準。

4.心肌細胞培養(yǎng)和干預

根據(jù)文獻選擇培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，方法如下［10－14］：取心臟左室并剪碎，予0.08%胰蛋白酶振蕩、消化（37℃）后離心細胞懸液 （－4℃，100 g，10 min），移沉淀物入培養(yǎng)皿，差速貼壁法獲取心肌細胞并接種于培養(yǎng)瓶，隔2天全量換含15%FBS的H－DMEM營養(yǎng)液；將心肌細胞隨機分為對照組和Adr組（1μmol／L），干預前24 h各組均 換 為L－DMEM （含15%FBS），干預時培養(yǎng)液中無FBS，干預時間均為96 h。

5.FCM 分析細胞凋亡率（Apoptosis Rate，AR）

將培養(yǎng)的兩組乳鼠心肌細胞消化、洗滌后并調(diào)整每樣本細胞數(shù)為1×106／m L，根據(jù)試劑盒說明書行FCM，激發(fā)光波長488 nm，用515 nm波長檢測FITC熒光、560nm波長檢測PI熒光，以二維點陣圖顯示并記錄凋亡細胞百分比。在FCM雙變量散點圖上，左下象限為活細胞（FITC－／PI－），右下象限為凋亡細胞（FITC＋／PI－）。每樣本至少檢測三次，取其均值。

6.Western blot檢測

提取心肌總蛋白后將其調(diào)至同一濃度，完成聚丙烯酰胺凝膠電泳（每孔加樣20μl）、轉膜、封閉后，分別加入IRE 1、XBP l、TRAF 2、ASK1、p－ASK1、JNK1／2、p－JNK1／2和 GAPDH 一抗（均1∶200稀釋），4℃孵育過夜，于洗膜后加入二抗（1∶400）孵育1h，完成后采用自動凝膠成像分析系統(tǒng)計算積分光密度（IOD），將其IOD分別與內(nèi)參IOD比值作為相應蛋白半定量指標。每樣本至少檢測三次并取其均值。

7.統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0軟件包行統(tǒng)計學處理，計量資料以均值±標準差（±s）表示，用One－way方差（One－way ANOVN）進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.Adr損傷心肌

在體研究顯示Adr組LVEF顯著低于對照組（0.53±0.03 vs 0.41±0.02%；圖1）。體外研究顯示阿霉素組心肌細胞凋亡率顯著高于對照組（23.3±4.0%vs 5.7±2.1%，P＝0.003；圖2）。

2.Adr對IRE1α的影響（圖3）

Adr構建的HF大鼠心肌組織中IRE1α和p－IRE1α水平均顯著高于對照組（P＝0.000），分別是對照組的4.42±0.35和3.47±0.20倍；與在體研究相似，Adr干預的心肌細胞亦顯著提高IRE1α和p－IRE1α的表達（P＝0.000），分別是對照組的5.41±0.27和4.91±0.45倍。

圖1 在體研究的各組LVEF。1：對照組，2：Adr組圖2 體外研究的各組心肌細胞AR。1：對照組，2：Adr組圖3 Western blot檢測IRE1α和p－IRE1α蛋白的表達。1：對照組，2：Adr組Fig.1 The mean± SD of LVEF in each group，in vivo.1：control group，2：Adr groupFig.2 AR of cardiomyocytes in each group，in vitro.1：control group，2：Adr groupFig.3 protein assay in each group by western blot.1：control group，2：Adr group

3.Adr對XBP l的影響（圖4、圖5）

與相應對照組相比，體內(nèi)（4.40±0.13倍，P＝0.000））、體外（4.51±0.12倍，P＝0.000）Adr組XBP l蛋白的表達均顯著升高。

4.Adr對TRAF 2的影響（圖4、圖5）

體內(nèi)和體外Adr組TRAF 2蛋白均顯著高于相應對照組（P＜0.001），分別是對照組的5.91±0.22和4.45±0.05倍。

圖4 Western blot檢測各組蛋白的表達1和2分別代表對照組和Adr組圖5 各組蛋白表達直方圖 分組內(nèi)的1和2分別代表對照組和Adr組；X軸上1、2、3、4、5、6分別代表XBP l、TRAF 2、ASK1、p－ASK1、JNK1／2和p－JNK1／2；1和2分別代表體內(nèi)和體外Fig.4 protein assay in each group by western blot 1 and 2 represents control group and Adr group，respectivelyFig.5 histogram of protein in each group 1 and 2，in each group，represents control group and Adr group，respectively；1，2，3，4，5 and 6，in X axis，represents XBP l，TRAF 2，ASK1，p－ASK1，JNK1／2 and p－JNK1／2，respectively；1 and 2 represents in vivo and ex vivo，respectively

5.Adr對ASK1的影響（圖4，5）

Adr構建的HF大鼠心肌組織中總ASK1和p－ASK1水平顯著高于對照組（P＜0.001），分別是對照組的2.79±0.11倍和3.44±0.10倍；Adr干預的心肌細胞亦顯著上調(diào)總ASK1和p－ASK1的表達（P＝0.000），分別是對照組的2.67±0.15倍和3.25±0.12倍。尤為重要的是，Adr組ASK1磷酸化水平（即p－ASK1與總ASK1比值）顯著上調(diào)（P＝0.000），體內(nèi)、體外分別是對照組1.46±0.11倍和1.24±0.10倍。

6.Adr對JNK1／2的影響（圖4，5）

不管在體內(nèi)或在體外，Adr組JNK1／2、p－JNK1／2蛋白和其磷酸化水平（即p－JNK1／2與總JNK1／2比值）均顯著高于相應對照組（P＝0.000），體內(nèi)分別是對照組的2.16±0.09倍、3.14±0.15倍和1.45±0.21倍，體外分別是對照組的2.03±0.06倍、3.23±0.11倍和1.58±0.15倍。

討 論

Adr致HF等的心臟毒性使其成為構建HF模型的經(jīng)典方法，不過，關于其毒性的確切機制并不清楚，雖然目前認為Adr致HF的機制涉及到多個方面［1，2］，但對其在ERS方面的研究罕見報道。誠然，ERS中的IRE1通路失衡在促進HF進程中起著重要作用［3－5］，但ERS中的IRE1通路是否介導其毒性并不清楚，因此，本研究從IRE1－ASK1－JNK通路方面探討Adr介導HF毒性的機制。

IRE1位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，是一個跨膜絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，非應激狀態(tài)下，IRE1與GRP78等分子伴侶結合成穩(wěn)定復合物而不被激活；應激時，IRE1與GRP78等分子伴侶被動解離，自發(fā)寡聚化和反式自磷酸化，繼而激活其梭基端的核糖核酸內(nèi)切酶域而具有核酸內(nèi)切酶活性［12，13］。本研究顯示Adr致HF及致體外培養(yǎng)的心肌細胞損傷時大量表達IRE1α和促進其磷酸化，提示IRE1α的表達和磷酸化獨立于HF之外，另外亦提示IRE1α過表達可能系細胞損傷的一個標記［14］和IRE1－ASK1－JNK通路的始動環(huán)節(jié)。Adr致IRE1表達和磷酸化可能系心肌細胞應激時IRE1與GRP78等分子伴侶分離并自磷酸化有關，但IRE1是否通過翻譯增加其表達以及是否通過其他方式激活等仍待探討。

IRE1通過剪切編碼XBP1 mRNA翻譯生成XBP1，具有活性的XBP1轉位至細胞核后上調(diào)ERS相關基因的表達，研究表明缺氧可促使乳鼠心肌細胞表 達 XBP1［15］，XBP1 適 度 表 達 可 通 過 上 調(diào)GRP78而增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理未折疊蛋白能力，但其過度持續(xù)表達卻促發(fā)細胞凋亡。本研究證實Adr致心肌損傷同時伴有XBP1蛋白表達的上調(diào)，提示其可能與Adr毒性效應相關，但其如何介導IRE1－ASK1－JNK通路并不明確?？扇苄缘鞍譚RAF2存在于胞漿內(nèi)，是將信號從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳向胞漿的關鍵介質(zhì)，具有抗凋亡和促凋亡雙重效應。本實驗發(fā)現(xiàn)Adr在致心肌損傷過程中上調(diào)IRE1和TRAF2表達，此提示IRE1－TRAF2信號通路被激活并參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞凋亡反應［14］。

活化的IRE1和TRAF2進一步激活ASK1－JNK途徑，而ASK1的激活可促進心肌細胞凋亡（包括非凋亡性細胞死亡）、心肌再灌注損害和心肌病，同時可激活JNK1／2［16，17］。本研究顯示 Adr既可在體內(nèi)又可在體外促發(fā)ASK1、p－ASK1的表達甚至促進其磷酸化水平，此無疑提示Adr的心肌毒性可直接通過其提高ASK1的表達和磷酸化水平實現(xiàn)。JNK信號通路是通過ERS介導細胞凋亡的重要信號通路，研究證明Adr干預顯著升高JNK表達和其磷酸化水平，敲出JNK基因或抑制JNK表達可減輕心肌細胞凋亡和改善心功能［18，19］，本研究進一步證實Adr可獨立于HF促發(fā)心肌表達JNK和促進其磷酸化水平。

總之，本研究在進一步證實阿霉素心肌毒性基礎上，較為系統(tǒng)的探討了Adr通過IRE1－ASK1－JNK通路致心肌損害的機制，最終顯示Adr通過上調(diào)和磷酸化IRE1α、提高XBP l和TRAF 2表達等進一步上調(diào)ASK1、JNK1／2蛋白和其磷酸化水平，從而導致HF的發(fā)生、發(fā)展；另外，不管是體內(nèi)或體外，各個因子的蛋白水平表達均一致等更進一步證實Adr致HF中的IRE1－ASK1－JNK通路獨立于HF之外。

［1］孔宏亮，宋麗杰，李占全等.人參皂甙Rbl對阿霉素心力衰竭大鼠致心臟纖維化因子表達的影響.南京醫(yī)科大學學報，2012，32（1）：26－29

［2］孔宏亮，袁龍，宋麗杰等.人參皂甙Rbl對阿霉素致心力衰竭大鼠心臟凋亡相關蛋白和mRNA表達的影響.廣東醫(yī)學，2012，33（15）：267－271

［3］Groenendyk J，Sreenivasaiah PK，Kim do H，et al.Biology of endoplasmic reticulum stress in the heart.Circ Res，2010，107（10）：1185－1197

［4］Xin W，Li X，Lu X，et al.Involvement of endoplasmic reticulum stress－associated apoptosis in a heart failure model induced by chronic myocardial ischemia.Int J Mol Med，2011，27（4）：503－509

［5］Groenendyk J，Michalak M.Endoplasmic reticulum quality control and apoptosis.Acta Biochim Pol，2005，52（2）：381－395

［6］Hongliang Kong，Zhanquan Li，Shumei Zhao，et al.Cardiac autonomic nerve fiber regeneration in chromic heart failure：do Akt gene－transduced mesenchymal stem cells promote repair.Neural Regeneration Research，2010，5（1）：28－34

［7］孔宏亮，李占全，袁龍.人參皂甙Rbl通過一氧化氮合酶／一氧化氮系統(tǒng)抑制血管緊張素Ⅱ所致的心肌細胞肥大.廣東醫(yī)學，2012，33（2）：167－169

［8］Hongliang Kong，Zhanquan Li，Shumei Zhao，et al.Cardiac autonomic nerve fiber regeneration in chromic heart failure：do Akt gene－transduced mesenchymal stem cells promote repair.Neural Regeneration Research，2010，5（1）：28－34

［9］Kong HL，Wang JP，Li ZQ，et al.Anti－h(huán)ypoxic effect of ginsenoside Rbl on neonatal rat cardiomyocytes is mediated through the specific activation of glucose transporter－4 ex vivo.Acta Pharmacol Sin，2009，30（4）：396－403

［10］趙穎軍，孔宏亮，李占全等.人參皂甙Rbl通過survivin改善乳鼠心肌細胞缺氧凋亡.廣東醫(yī)學，2010，31（21）：2760－2762

［11］孔宏亮，趙穎軍，陳敏等.高糖對乳鼠心肌細胞葡萄糖轉運載體－4的影響.廣東醫(yī)學，2010，31（11）：1387－1389

［12］Buck TM，Wright CM，Brodsky JL.The activities and function of molecular chaperones in the endoplasmic reticulum.Semin Cell Dev Biol，2007，18（6）：751－761

［13］Malhotra JD，Kaufman RJ.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress：a vicious cycle or a double－edged sword？Antioxid Redox Signal，2007，9（12）：2277－2293

［14］Sari FR，Watanabe K，Widyantoro B，et al.Partial inactivation of cardiac 14－3－3 protein in vivo elicits endoplasmic reticulum stress（ERS）and activates ERS－initiated apoptosis in ERS－induced mice.Cell Physiol Biochem，2010，26（2）：167－178

［15］Thuerauf DJ，Marcinko M，Gude N，et al.Activation of the unfolded protein response in infarcted mouse heart and hypoxic cultured cardiac myocytes.Circ Res，2006，99：275－282

［16］Minn Y，Cho KJ，Kim HW，et al.Induction of apoptosis signal－regulating kinase 1 and oxidative stress mediate agedependent vulnerability to 3－nitropropionic acid in the mouse striatum.Neurosci Lett，2008，430（2）：142－146

［17］Liu Q，Sargent MA，York AJ，et al.ASK1 regulates cardiomyocyte death but not hypertrophy in transgenic mice.Circ Res，2009，105（11）：1110－1117

［18］Ghosh J，Das J，Manna P，et al.The protective role of arjunolic acid against doxorubicin induced intracellular ROS dependent JNK－p38 and p53－mediated cardiac apoptosis.Biomaterials，2011，32（21）：4857－4866

［19］Das J，Ghosh J，Manna P，et al.Taurine suppresses doxorubicin－triggered oxidative stress and cardiac apoptosis in rat via up－regulation of PI3－K／Akt and inhibition of p53，p38－JNK.Biochem Pharmacol，2011，81（7）：891－909