甘滿權(quán)，唐小蘭，唐剛?cè)A，王紅亮，胡孔珍

(1.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 PET/CT中心，廣州 510230;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，廣州 510642; 3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科， 廣州 510515)

11C-乙酸鹽(11C-AC)是用于測定心腦氧化代謝、多種腫瘤 (如泌尿道腫瘤、頭頸部癌、肝細(xì)胞癌等)類脂代謝的正電子發(fā)射斷層(PET)顯像劑，具有較高的靈敏度，優(yōu)于2-18F-2-脫氧-D-葡萄糖(18F-FDG)[1-3]。國外已報(bào)道了多種11C-乙酸鹽的自動(dòng)化合成方法[4-12]，國內(nèi)也有文獻(xiàn)[13]報(bào)道，主要有Loop環(huán)固相反應(yīng)法和液相反應(yīng)法，前體主要為溴化甲基鎂和氯化甲基鎂，改進(jìn)處主要集中在11C-AC純化方法。純化方法有：1) 液-液提取法[14]。該法麻煩耗時(shí)，得到的11C-AC放化產(chǎn)率較低，合成時(shí)間較長，不便于實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化生產(chǎn)。2) HPLC純化法[15]。該法得到的11C-AC放化產(chǎn)率較高(校正產(chǎn)率約72%)，放化純度也高(>99%)，但11C半衰期短，HPLC純化耗時(shí)，合成時(shí)間較長，也不便于實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化生產(chǎn)。(3)蒸餾法[5-6]。除去中間體11C-乙酰溴(或氯)化鎂加合物中溶劑四氫呋喃后，加入酸并加熱將11C-AC從溶液中蒸出。該法放化產(chǎn)率較低，合成時(shí)間較長，最終產(chǎn)品中可能含有機(jī)雜質(zhì)11C-丙酮和11C-叔丁醇。(4) 固相小柱純化法[4, 7-13, 16]。該法放化純度、化學(xué)純度和放化產(chǎn)率均較高，是目前合成乙酸鹽最常用的方法。但是，該法可能生成AgCl或AgBr沉淀而造成管路堵塞和11C-AC合成失敗，且終產(chǎn)品中需要加酸除11CO2并用堿中和，給11C-AC自動(dòng)化生產(chǎn)帶來不便。最近報(bào)道的液相反應(yīng)結(jié)合中性氧化鋁小柱純化法[16]，可彌補(bǔ)Loop環(huán)固相反應(yīng)結(jié)合固相小柱純化法的不足，但中性氧化鋁小柱捕集11C-AC有限，也會(huì)損失部分11C-AC。本工作采用改進(jìn)的Loop環(huán)合成11C-Ac，結(jié)合固相小柱水解純化法，在國產(chǎn)碳-11膽堿/蛋氨酸合成模塊中進(jìn)行11C-AC的自動(dòng)化合成，并建立簡單放射性HPLC測定11C-AC放化純度，為11C-AC自動(dòng)化合成提供簡便、快速、實(shí)用的合成工藝。

1 實(shí)驗(yàn)材料

碳-11膽堿/蛋氨酸自動(dòng)化合成模塊：派特北京科技有限公司；LC-10AT HPLC分析系統(tǒng)：日本Shimadzu公司產(chǎn)品，配有LB 508 型放射性流量探測器，德國EG&G公司產(chǎn)品；質(zhì)檢HPLC分析條件：Xdp-C18柱(4.5 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為5%的乙腈溶液，流速為1 mL/min，紫外(UV)檢測波長為214 nm，美國 Agilent公司；CS-9301 PC 薄層層析掃描儀：日本Shimadzu公司產(chǎn)品；γ計(jì)數(shù)儀：上海原子核研究所產(chǎn)品；CRC-15R型活度計(jì)：美國CAPINTEC公司產(chǎn)品；Sep-Pak C18小柱：美國Waters公司產(chǎn)品；掏空Sep-Pak Plus C18小柱和Sep-Pak Al2O3中性小柱：經(jīng)消毒酒精和無菌水處理后，裝載AG50w-X8樹脂(H+型，Bio-Rad公司產(chǎn)品)或AG11A8離子滯留樹脂，Bio-Rad公司產(chǎn)品，分別制作Sep-Pak Tscx小柱(600 mg)和Sep-Pak Tix小柱(1 200 mg)；硅膠60薄層層析鋁板：德國Merck公司產(chǎn)品；1.0 mol/L溴化甲基鎂：Across Organics公司產(chǎn)品；NaOH、冰乙酸：分析純，廣州化學(xué)試劑公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 合成方法

11C-AC合成路線示于圖1。采用柱水解法自動(dòng)化合成11C-AC。以溴化甲基鎂為前體，在Loop環(huán)中與11CO2反應(yīng)生成中間體11C-乙酰溴化鎂加合物。該步不經(jīng)純化過程，通N2除凈四氫呋喃(THF)后，加水依次通過一體化小柱(Sep-Pak Plus C18小柱、Sep-Pak Tscx小柱和Sep-Pak Tix小柱)，中間體11C-乙酰溴(或氯)化鎂在Sep-Pak Tscx小柱中發(fā)生進(jìn)一步水解，并經(jīng)一體化小柱分離純化后，得11C-AC 注射液。

圖111C-AC合成路線

圖1Syntheticrouteof11C-AC

2.2 實(shí)驗(yàn)流程

采用碳-11膽堿/蛋氨酸模塊合成11C-AC，其合成流程示于圖2。在合成前，取濃度為0.87～1.5 mol/L的溴化甲基鎂無水四氫呋喃溶液0.1 mL裝于Loop環(huán)2中，Loop環(huán)2置于活度計(jì)內(nèi)。由PETtrace回旋加速器通過14N(p, α)11C核反應(yīng)生產(chǎn)11CO2，11CO2在液氮冷卻下被捕集在置于冷阱的Loop環(huán)1中。在室溫下，以10 mL/min N2作載氣將11CO2載帶至Loop環(huán)2中，并與環(huán)中的溴化甲基鎂反應(yīng)生成中間體乙酰溴化鎂加合物，溶劑四氫呋喃在氮?dú)廨d帶下被傳至廢液瓶中。1號(hào)瓶中5 mL水在N2作用下(30 mL/min)經(jīng)Loop環(huán)2將乙酰溴化鎂載至一體化小柱，在柱上進(jìn)一步發(fā)生水解反應(yīng)。收集產(chǎn)品在無菌真空小瓶4中，繼續(xù)通入30 mL/min N2流除去酸性條件下釋放的11CO2。經(jīng)堿溶液中和后過無菌濾膜得11C-AC注射液。

圖2 碳-11膽堿/蛋氨酸模塊合成11C-AC示意圖Fig.2 Schematic diagram of 11C-AC synthesis using 11C-choline/methionine synthesizer

2.3 產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)

用精密pH試紙測定注射液的pH，目測其顏色和澄清度。取即時(shí)制備的11C-AC注射液，用活度計(jì)測定不同時(shí)間點(diǎn)的活度，用半對(duì)數(shù)作圖法估測半衰期和核純度。用放射性HPLC系統(tǒng)及TLC法[5]測定11C-AC注射液的化學(xué)純度和放化純度。TLC硅膠鋁板，樣品加入1 mol/L NaOH后點(diǎn)樣，展開劑為甲醇[11]。

按中華人民共和國藥典2010年版所述方法對(duì)11C-AC注射液進(jìn)行異常毒性檢查、無菌檢查及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。異常毒性檢查：4組小鼠，每組10只，每只尾靜脈給予0.5 mL衰變后的11C-AC注射液，觀察48 h后小鼠生長情況。

2.4 正常和模型動(dòng)物PET/CT顯像

腹腔注射10%的水合氯醛麻醉SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)兔(約3 kg)，經(jīng)耳緣靜脈注射0.6 mL的11C-AC (18.5 MBq)，固定于掃描床上。于注射20 min后行PET/CT全身顯像，經(jīng)衰減校正和迭代重建后，獲得橫斷面、矢狀面、冠狀面斷層圖像及最大密度投影(maximum intensity projection，MIP)圖像。

將S180纖維肉瘤細(xì)胞株復(fù)蘇后，培養(yǎng)3～4代，制成癌細(xì)胞懸浮液，調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL，取0.1 mL注射到小鼠右肩皮下。接種后第10天，小鼠右背部可見明顯的腫塊，瘤直徑大于1 cm入選為腫瘤模型。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，恒溫恒濕條件，定時(shí)給食。S180型纖維肉瘤模型小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，由尾靜脈注射生理鹽水稀釋的11C-AC 約1.85～3.7 MBq (0.2 mL)，20 min后固定于小鼠架上，行全身PET/CT掃描。經(jīng)衰減校正和迭代重建后，獲得橫斷面、矢狀面、冠狀面斷層圖像及MIP圖像。

3 結(jié)果與討論

3.1 11C-AC自動(dòng)化合成

采用碳-11膽堿/蛋氨酸模塊，以1 mol/L溴化甲基鎂作前體，可自動(dòng)化合成11C-AC，總過程耗時(shí)約8 min，總校正放化產(chǎn)率為(40.5±4.6)%(n=6)。廢液中放射性約占24%，一體化小柱中放射性約占8%，還有約27%為未反應(yīng)的11CO2(通氮?dú)獬?和反應(yīng)過程損失的放射性。用PETtrace加速器和質(zhì)子束流25 μA轟擊5 min，得 7.9 GBq的11CO2，可生產(chǎn)2.6 GBq的11C-AC注射液。

采用0.2 mL 0.9 mol/L溴化甲基鎂替代0.1 mL 1.5mol/L溴化甲基鎂，廢液中放射性下降，粗產(chǎn)品中11CO2含量上升，標(biāo)記率略降低。采用1 mol/L和1.5 mol/L溴化甲基鎂作前體，可獲得相同的放化產(chǎn)率。

本工作采用一體化小柱完成水解和純化工作，與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的小柱純化法[4, 7-13，16]相比，本法很容易實(shí)現(xiàn)11C-AC的自動(dòng)化合成，總合成時(shí)間較短。中間體11C-乙酰溴化鎂加合物可在Sep-Pak Tscx強(qiáng)陽離子小柱中完成水解，從而可得較純11C-AC注射液。

3.2 11C-AC質(zhì)量檢驗(yàn)

11C-AC注射液為無色或淺黃色溶液，pH約為7.0，比活度≥4.6×1011Bq/g。用時(shí)間衰變法測定11C半衰期約為20 min，放射性核純度大于99%。

采用HPLC法測量11C-AC注射液的放化純度，主峰(圖3A)與標(biāo)準(zhǔn)品乙酸的紫外吸收峰(圖3B)保留時(shí)間一致，11C-AC放化純度大于95%。用放射性TLC法測定，11CO2在原點(diǎn)，11C-AC的Rf=0.8，11C-AC放化純度大于98%。

圖3 HPLC測定純化后11C-AC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of purified 11C-AC. Figure A is radioactivity chromatogram and Figure B is UV chromatogram

此外，經(jīng)放射性HPLC法測定，11C-AC 注射液在2 h內(nèi)放化純度沒有明顯變化，均大于95%。異常毒性檢查：尾靜脈給予11C-AC注射液0.5 mL后，觀察48 h后，發(fā)現(xiàn)小鼠生長正常，無死亡及不良反應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生，解剖后觀察，未見任何器官損傷。無菌檢查和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均為陰性。

3.3 動(dòng)物PET/CT顯像

給予11C-AC后20 min，對(duì)正常實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行全身PET/CT顯像，顯像結(jié)果示于圖4。由圖4可知，肺和肝臟有較高放射性分布，其他組織放射性攝取較低。

a—冠狀CT斷層圖；b—冠狀PET斷層圖；c—冠狀PET/CT融合圖；d—冠狀MIP圖。圖4 正常兔全身11C-AC PET/CT顯像圖像a—coronal CT image；b—coronal PET image；c—coronal PET/CT fused image；d—coronal MIP imageFig.4 Whole-body 11C-AC PET/CT images of normal rabbit

另給予11C-AC后20 min，對(duì)荷S180纖維肉瘤小鼠行全身PET/CT顯像，獲得顯像圖示于圖5。放射性主要分布于上腹部；給藥后20 min，腫瘤組織有較低放射性攝取(腫瘤與健側(cè)肌肉放射性攝取比約為1.5)，其原因可能是S180纖維肉瘤對(duì)11C-乙酸鹽的攝取不夠敏感。給藥后30 min，腫瘤組織放射性攝取略有增加(腫瘤與健側(cè)肌肉放射性攝取比約為2.2)。

a—CT斷層圖；b—PET/CT橫斷層融合圖；c—冠狀PET/CT融合圖；d—冠狀MIP圖。圖5 荷S180纖維肉瘤小鼠全身PET/CT顯像圖像。a—Transverse CT images; b—Transverse PET/CT fused images;c—coronal PET/CT fused images; d— coronal MIP images.Fig.5 Whole body PET/CT images of S180 fibrosarcoma-bearing mice

4 小結(jié)

本工作建立了簡單、快速自動(dòng)化合成11C-乙酸鹽(11C-AC)的工藝流程，總合成時(shí)間約8 min，校正放化產(chǎn)率為(40.5±4.6)%，放化純度大于95%，經(jīng)質(zhì)量控制檢驗(yàn)后符合放射性藥物質(zhì)量要求，并經(jīng)正常動(dòng)物和模型動(dòng)物PET/CT顯像驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自動(dòng)化生產(chǎn)的11C-AC是安全、有效的，有望進(jìn)一步用于人體PET/CT研究。

參考文獻(xiàn):

[1]Ho CL, Yu SC, Yeung DWC.11C-Acetate PET Imaging in Hepatocellular Carcinoma and Other Liver Masses [J]. J Nucl Med, 2003, 44:213-221.

[2]Sun A, Sorensen J, Karlsson M, et al. 1-[11C]-acetate PET imaging in head and neck cancer—a comparison with18F-FDG-PET: implications for staging and radiotherapy planning [J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2007, 34: 651-657.

[3]唐剛?cè)A, 伍光遠(yuǎn). 正電子發(fā)射斷層顯像在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用[J]. 同位素, 2007, 20(2): 114-119.

Tang ganghua, Wu guangyuan. Clinical Application of Positron Emission Tomography Imaging in Urologic Tumors[J]. Journal of Isotopes, 2007, 20(2): 114-119(in Chinese).

[4]Moerlein SM, Gaehle GG, Welch MJ. Robotic preparation of Sodium Acetate C 11 Injection for use in clinical PET [J]. Nucl Med Biol, 2002, 29: 613-621.

[5]Mitterhauser M, Wadsak W, Krcal A, et al. New aspects on the preparation of [11C]acetate—a simple and fast approach via distillation [J]. Appl Radiat Isot, 2004, 61: 1 147-1 150.

[6]Cheung M, Ho CL. A simple, versatile, low-cost and remotely operated apparatus for [11C]acetate, [11C]choline, [11C]methionine and [11C]PIB synthesis [J]. Appl Radiat Isot, 2009, 67: 581-589.

[7]Roeda D, Dolle F, Crouzel C. An improvement of [11C]acetate synthesis—non-radioactive contaminants by irradiation-induced species emanating from the [11C]carbon dioxide production target [J]. Appl Radiat Isot, 2002, 57: 857-860.

[8]Kruijer PS, Linden TT, Mooij R, et al. A practical method for the preparation of [11C]acetate [J]. Appl Radiat Isot, 1995, 46: 317-321.

[9]Lodia F, Trespidia S, Pierro DD, et al. A simple Tracerlab module modification for automated on-column [11C]methylation and [11C]carboxylation [J]. Appl Radiat Isot, 2007, 65: 691-695.

[10]Felicinia C, Nagrenc K, Bertonb A, et al. Development of an automated modular system for the synthesis of [11C]acetate [J]. Nucl Med Commun, 2010, 31:1 033-1 039.

[11]Le Bars D, Malleval M, Bonnefoi F, et al. Simple synthesis of [1-11C]acetate [J]. J Label Compd Radiopharm, 2006, 49: 263-267.

[12]Soloviev D, Tamburella C. Captive solvent [11C]acetate synthesis in GMP conditions [J]. Appl Radiat Isot, 2006, 64: 995-1 000.

[13]張錦明, 田嘉禾, 陳燕等.11C-膽堿模塊合成11C-乙酸鹽的研究[J]. 中華核醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 28(5): 319-322.

Zhang Jinming, Tian Jiahe, Chen yan, et al. A study of11C-acetate production using11C-choline commercial module[J]. Chinese Journal of Nuclear Medicine, 2008, 28(5): 319-322(in Chinese).

[14]Berridge MS, Cassidy EH, Miraldi F. [11C]acetate and [11C]methionine: Improved syntheses and quality control [J]. Appl Radiat Isot, 1995, 46(3): 173-175.

[15]Pike VW, Horlock PL, Brown C, et al. The remotely-controlled preparation of a11C-labelled radiopharmaceutical—[11C]acetate [J]. Int J Appl Radiart Isot, 1984, 35(7): 623-627.

[16]Mock BH, Brown-Proctor C, Green MA, et al. An automated SPE-based high-yield synthesis of [11C]acetate and [11C]palmitate: no liquid-liquid extraction, solvent evaporation or distillation required [J]. Nucl Med Biol, 2011, 38: 1 135-1 142.