刁 堯, 劉新寧,, 蘭振和, 馬 婧, 趙文瑾, 劉 潔, 趙 恂, 于成國(guó)， 崔澤實(shí)

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110001；2.阜新市第二人民醫(yī)院，遼寧 阜新 123000)

茶多酚(teapolyphenols，Tp)是茶葉的有效成分之一，主要由兒茶素、黃酮、酚酸、花色素4大類物質(zhì)組成,作為其主要成分的兒茶素(catechins)占茶多酚總量的60%～80%，主要包括的單體化合物有表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)等[1]。EGCG藥理作用廣泛，主要表現(xiàn)在抗氧化、抗自由基損傷、抗凋亡、防癌抗癌、抗突變、抗糖尿病、降血脂、降低膽固醇、抑制細(xì)菌病毒、保護(hù)腦和脊髓組織氧化損傷等作用[2-7]。EGCG抗氧化作用的機(jī)制是其分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基易氧化形成鄰醌，而鄰醌又不穩(wěn)定，易發(fā)生復(fù)雜的聚合、縮合反應(yīng)，而形成雙黃烷醇類、茶黃素類和茶紅素等，它的抗氧化活性是維生素E的20倍，過氧化物酶(SOD)的6倍[8]。Masami[9]等利用放射性核素3H標(biāo)記的3H-EGCG對(duì)CD-1小鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)雌性小鼠灌胃后1 h，3H-EGCG在胃、小腸的吸收達(dá)高峰，其放射性分別占總放射性的30.7%、40.6%，灌胃后6 h，結(jié)腸吸收達(dá)高峰，放射性為16.7 %，其他器官的放射性隨時(shí)間增加而逐漸升高，24 h達(dá)高峰，證實(shí)EGCG可在小鼠體內(nèi)廣泛分布。

雖然EGCG的藥效涉及很多方面，但其在生物體內(nèi)的具體代謝和分布行為的報(bào)道較少，為了對(duì)EGCG相關(guān)藥效進(jìn)行更深入研究，本研究擬采用放射性示蹤法分析EGCG在小鼠體內(nèi)的生物分布，以揭示其主要的代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Iodogen、EGCG(純度大于95%)：Sigma公司；Na125I：中國(guó)原子能科學(xué)研究院；KM小鼠(SYXK(遼)2008-0005)：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；γ-計(jì)數(shù)儀(FJ-2008PS)：西安核儀器廠；微機(jī)放射性活度計(jì)(FJ-391A2):北京核儀器廠；磷屏成像儀(PMI 170-9400，Bio-Rad)：美國(guó)；聚酰胺薄膜：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 125I-EGCG制備

EGCG的分子結(jié)構(gòu)式示于圖1。采用Iodogen法對(duì)EGCG進(jìn)行125I標(biāo)記。標(biāo)記管中預(yù)先涂以50 μg Iodogen，向標(biāo)記管中依次加入50 μLEGCG樣品(1 g/L，無水乙醇溶解)，10 μL 18.5 MBq Na125I，振蕩反應(yīng)10 min，以生理鹽水溶解，放置備用。以聚酰胺薄膜為支持介質(zhì)，生理鹽水為展開劑，測(cè)定其標(biāo)記率和放化純度。

圖1 EGCG的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of EGCG

1.3 125I-EGCG標(biāo)記率和比活度

采用薄層層析法，吸取碘化反應(yīng)液2 μL，在距聚酰胺薄膜薄層層析板底端1 cm處點(diǎn)樣，游離125I-作為對(duì)照點(diǎn)樣，點(diǎn)樣直徑0.2 cm，冷風(fēng)吹干。以生理鹽水為展開劑，上行展開，展開結(jié)束后晾干，磷屏成像儀成像，然后分段剪取聚酰胺層析板，經(jīng)γ放免計(jì)數(shù)儀測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算標(biāo)記率和放射性比活度。標(biāo)記物的標(biāo)記率(%)=(125I-EGCG的放射性計(jì)數(shù)/點(diǎn)樣量總放射性計(jì)數(shù))×100；比活度(Bq/μg)=(放射性核素投入總活度×標(biāo)記率)/投入的EGCG總量。

1.4 125I-EGCG的純化

采用柱層析法，Sephadex G-25玻璃層析柱，1 cm×25 cm，使Sephadex G-25均勻沉積至20 cm，多余的吸出，勿使柱干掉。將反應(yīng)混合液用微量加樣器移至Sephadex G-25柱，待全部反應(yīng)液完全進(jìn)柱后，開始用pH 7.5，0.05 mol/L PB洗脫，流速約每分鐘10滴，每管收集10滴(約0.5 mL)，逐管收集。為防止125I-EGCG在收集管上吸附，各管可預(yù)先用EGCG飽和。依次測(cè)定各收集管的放射性計(jì)數(shù)，各管集中，冷風(fēng)吹干存冰箱待用，以計(jì)數(shù)率為縱坐標(biāo)，管數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。以生理鹽水為展開劑，液面稍低于樣品位置，上行展開，展開結(jié)束后晾干，磷屏成像儀成像，然后分段剪取聚酰胺層析板，經(jīng)γ放免計(jì)數(shù)儀測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算放化純度。標(biāo)記物的放化純度(%)=(125I-EGCG的放射性計(jì)數(shù)/點(diǎn)樣量總放射性計(jì)數(shù))×100。

1.5 125I-EGCG 標(biāo)記化合物的體外穩(wěn)定性

取50 μL純化后的標(biāo)記物分別加入100 μL生理鹽水和新鮮人血清中。在37 ℃下貯存，分別于2、24、48 h取樣，聚酰胺薄膜層析測(cè)定放化純度，觀察標(biāo)記物的穩(wěn)定性。

1.6 125I-EGCG的小鼠體內(nèi)分布

35只雄性KM小鼠(約20 g，4周齡)隨機(jī)分為7組，每組5只，每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射200 μL125I-EGCG(約185 kBq)，分別于注射后5、10、30、60、120、240、1 440 min斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨骼、胃、小腸、大腸、睪丸、腦、脊髓、甲狀腺、頜下腺、血，稱重，測(cè)各組織樣品放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織放射性攝取率(%ID·g-1)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 125I-EGCG標(biāo)記率

在以聚酰胺薄膜為支持介質(zhì)、生理鹽水為展開劑的體系中，125I-EGCG的Rf為0～0.1，游離的Na125I的Rf為0.8～0.9。經(jīng)測(cè)定，125I-EGCG的標(biāo)記率達(dá)89.4%。

2.2 125I-EGCG的純化

經(jīng)柱層析純化，洗脫圖譜示于圖2，其中第一峰為125I-EGCG峰，第二峰為游離的125I組分。按1.4節(jié)和1.3節(jié)計(jì)算，其放化純度為96.4%，放射性濃度為65.58 GBq/L，比活度為0.47 TBq/μg。

圖2 125I-EGCG層析分離純化Fig.2 Purification of iodinated EGCG With gel chromatography

2.3 125I-EGCG的體外穩(wěn)定性

125I-EGCG體外穩(wěn)定性結(jié)果示于圖3，由圖3可以看出，標(biāo)記物在人血清和生理鹽水兩種體系中，37 ℃下放置48 h，標(biāo)記物的放化純度仍大于90 %，表明標(biāo)記物在37 ℃環(huán)境下體外穩(wěn)定性較好。

◆——人血清；■— 生理鹽水圖3 125I-EGCG的體外穩(wěn)定性Fig.3 Stability of 125I-EGCG in vitro

2.4 125I-EGCG小鼠體內(nèi)生物分布

125I-EGCG小鼠體內(nèi)生物分布結(jié)果列于表1，由表1可知，靜脈注射給藥后125I-EGCG在體內(nèi)分布廣泛。血中清除較快，注射后5 min時(shí)即達(dá)峰值，其放射性攝取率為11.95%ID·g-1；胃、小腸、頜下腺、肝、腎和肺中分布較高，注射后30 min時(shí)胃、小腸、頜下腺吸收達(dá)峰值，其放射性攝取率分別為15.92、5.83、11.56%ID·g-1，注射后5 min時(shí)肝、腎、肺攝取達(dá)高峰，其 放射性攝取率分別為5.21、5.93、3.49%ID·g-1，而后緩慢下降；注射后4 h時(shí)胃、小腸、頜下腺、肝、腎、肺的放射性攝取率分別為2.75、1.21、2.62、0.54、1.73、0.73%ID·g-1，表明125I-EGCG在體內(nèi)主要經(jīng)胃、小腸、頜下腺、肝、腎、肺組織吸收及代謝；125I-EGCG能夠通過血腦屏障，但在腦和脊髓中分布較少，注射后5 min時(shí)其放射性攝取率分別為0.51、0.45%ID·g-1；睪丸內(nèi)125I-EGCG分布亦較多，注射后30 min時(shí)其放射性攝取率為4.87%ID·g-1；甲狀腺內(nèi)的放射性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，甲狀腺與血液的放射性攝取比由靜脈注射125I-EGCG后5 min時(shí)的1.95倍升至240 min時(shí)的181倍，與時(shí)間基本呈線性關(guān)系。

表1 125I-EGCG在小鼠體內(nèi)的生物分布

3 小結(jié)

125I-EGCG體外穩(wěn)定性結(jié)果顯示，標(biāo)記后48 h的放化純度維持90 %以上(溶于新鮮人血清中)，適于EGCG在體內(nèi)外的微量示蹤研究，為下一步研究提供了可靠保障。利用125I-EGCG具有靈敏準(zhǔn)確的放射性示蹤特點(diǎn)，可用于觀察分析其生物體內(nèi)的代謝過程和可能的作用靶點(diǎn)。125I可能標(biāo)記在鄰苯三酚羥基鄰位上[1]，即125I取代H,(見圖1中*號(hào)位置)，還可能標(biāo)記在間苯二酚羥基鄰位上。

小鼠體內(nèi)分布結(jié)果顯示，靜脈注射給藥后125I-EGCG在體內(nèi)廣泛分布，主要分布于胃、小腸、頜下腺、肝、肺、腎，其中，以胃、頜下腺、小腸分布最多，腎、肝、肺次之，說明胃、頜下腺、小腸對(duì)EGCG具有很高的攝取率，EGCG是通過消化道被吸收，這也可解釋 EGCG具有抑制大腸粘膜磷脂氫過氧化物形成的潛在抗氧化功能[10-13]。腎、肝、肺臟是其主要的代謝器官，結(jié)果提示，125I-EGCG可為EGCG保護(hù)胃、小腸、腎、肝、肺臟的研究提供靈敏的分析方法。EGCG在腦、脊髓中有一定分布，揭示其能夠透過血腦屏障(BBB)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。

125I-EGCG在甲狀腺內(nèi)的放射性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，反映出其在體內(nèi)有一個(gè)漸進(jìn)性的脫碘過程；同時(shí)體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示其在生理鹽水中穩(wěn)定性逐漸降低。從EGCG分子結(jié)構(gòu)分析，其分子結(jié)構(gòu)存在多個(gè)酚羥基，故易發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，包括甲基化，硫酸結(jié)合，葡萄糖醛酸結(jié)合乃至半胱氨酸結(jié)合，125I-EGCG本身不穩(wěn)定等原因均會(huì)導(dǎo)致脫碘，另外，體內(nèi)的脫碘酶也會(huì)導(dǎo)致125I-EGCG脫碘。

EGCG在體內(nèi)的分布代謝研究雖已有大量報(bào)道，但大都利用液相色譜方法，樣品處理比較繁瑣，125I-EGCG能靈敏地反映其在小鼠體內(nèi)的基本代謝過程，可進(jìn)一步結(jié)合其他分子生物學(xué)技術(shù)分析其在體內(nèi)精確的代謝行為及可能的作用機(jī)制。

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