張 偉 張顏波 張 姝 姜樹原 栗 鵬 孟憲梅 邵 國

(1.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014030； 2. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 山東 泰安 27100； 3.包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

腺瘤性大腸息肉(colorectal adenomatous polyps，CAP)到癌的順序?qū)W說即絕大部分大腸癌是由腺瘤或經(jīng)過一定的腺瘤期演變而來,目前已得到了公認(rèn)：最初的正常的上皮細(xì)胞過度增生，隱窩灶和腺瘤的形成，并最終過渡到具有浸潤的大腸癌(colorectal cancer，CRC)[1]。眾所周知，異常DNA甲基化是一些病理現(xiàn)象的原因，癌癥一般均表現(xiàn)為整體基因組甲基化降低和抑癌基因啟動區(qū)甲基化升高，這些甲基化變化導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)改變和基因表達(dá)發(fā)生異常。在大腸息肉中也存在著整體基因組甲基化降低和抑癌基因啟動區(qū)高甲基化的現(xiàn)象[2-3]，因此，在DNA甲基化方面大腸息肉的發(fā)生可能與癌癥有某些相似之處。

DNA的甲基化是靠DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT) 催化完成的。雖然有異常甲基化現(xiàn)象在大腸息肉中的報(bào)道，但DNMT在其中的作用尚未見報(bào)道，本研究用real-time PCR技術(shù)檢測了腺瘤性大腸息肉及正常的大腸粘膜組織中三種DNMTs(DNMT1、3A和3B mRNA)表達(dá), 探討DNMTs mRNA在腺瘤性大腸息肉發(fā)生發(fā)展中的作用, 以期進(jìn)一步了解腺瘤性大腸息肉的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及試劑

7例CAP和7例正常大腸粘膜樣本均來自包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院的新鮮標(biāo)本；Trizol, Invitrogen; superscripⅡRT 酶(1 ×108U/ L ) , Invitrogen ; 隨機(jī)引物(0. 5 g/ L) , 2×PCR mix(南京凱基)；焦碳酸二乙酯(DEPC) ,Sigma ；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 引物

根據(jù)文獻(xiàn)和Genebank序列，用Primer premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)DNMT1、3A和3B及內(nèi)參β-actin基因的引物。引物由上海生物公司合成，引物序列如下[4]。

β-actin F： 5'-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3'；

β-actin R： 5'-GGTCATTGATGGCAACAA-3'；

DNMT3A F : 5-GACAAGAATGCCACCAAAGC;

DNMT3A R: 5-CGTCTCCGAACCACATGAC;

DNMT1F：AACCTTCACCTAGCCCCAG；

DNMT1R：CTCATCCGATTTGGCTCTTTCA；

DNMT3B F：AGGGAAGACTCGATCCTCGTC；

DNMT3B R： GTGTGTAGCTTAGCAGACTGG；

1.3 RT-PCR及real-time PCR

RT-PCR：用Trizol提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度和含量。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，得到20 μl cDNA產(chǎn)物-20℃保存。使用ABI的96孔板，每孔依次加入cDNA 1μl，2×mix 12.5 μl，3′和5′端引物(5μmol·L-1) 各1 μl，無菌水9.5 μl，在ABI 7900 real-time PCR反應(yīng)儀上反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)空。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min，再進(jìn)行92 ℃，30 s；54.5 ℃，35 s；72 ℃，30 s(40 cycles)，最后72 ℃延伸5 min停止反應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

腺瘤性大腸息肉和正常粘膜組織中DNMT 1mRNA對β-actin mRNA的相對豐度值分別是1.02×10-3±4.87×10-4和8.67×10-4±2.18×10-4, 大腸息肉組織中與正常粘膜組織中DNMT1表達(dá)無顯著差異(P>0.05)(圖1)； 腺瘤性大腸息肉和正常粘膜組織中DNMT3A mRNA對β-actin mRNA的相對豐度值分別是3.26×10-2±4.96×10-3和3.00×10-2±5.20×10-4,兩組在DNMT3A mRNA表達(dá)上無顯著性差異(P>0.05)(圖2)； 腺瘤性大腸息肉和正常粘膜組織中DNMT 3B mRNA對β-actin mRNA的相對豐度值分別是3.26×10-2±4.96×10-3and 3.00×10-2±5.20×10-4，大腸息肉組織中與正常粘膜組織中DNMT 3B表達(dá)有顯著差異(P<0.05)(圖3)。

圖1 DNMT1 mRNA 對β-actin mRNA相對豐度圖 CAP：腺瘤性大腸息肉； N：正常大腸粘膜

圖2 DNMT3A mRNA 對β-actin mRNA相對豐度圖 CAP：腺瘤性大腸息肉； N：正常大腸粘膜

圖3 DNMT3B mRNA 對β-actin mRNA相對豐度圖 CAP：腺瘤性大腸息肉； N：正常大腸粘膜

3 討 論

基因5′的CpG島中C的甲基化與基因表達(dá)變化密切相關(guān)[5]，有研究顯示大腸腺瘤性息肉中有抑癌基因的異常甲基化和基因沉默現(xiàn)象[6]，而這種DNA甲基化的變化與腫瘤的DNA甲基化變化相同或相似，可能是其癌變的重要原因。催化DNA甲基化的酶為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)，其可以將S腺苷甲硫氨酸上(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到DNA中胞嘧啶第五位碳原子上，到目前為止發(fā)現(xiàn)的3種的有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的DNMT為DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，其中DNMT1的底物是半甲基化的雙鏈DNA，DNMT3A和DNMT3B的底物為沒有甲基化的雙鏈DNA[7]。由于大腸息肉中有異常甲基化現(xiàn)象，而DNMT在此過程中可能有重要作用，因此本研究對3種有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的DNMT在腺瘤性大腸息肉中的表達(dá)情況進(jìn)行研究。

本研究結(jié)果顯示DNMT1和DNMT3A mRNA在腺瘤性大腸息肉和正常粘膜組織沒有顯著性差異，而DNMT3B mRNA在正常粘膜組織和大腸息肉中有顯著差異(P<0.05)，大腸息肉中DNMT3B的mRNA表達(dá)增加。Guo等研究顯示在中國青年漢族人群中DNMT3B單核苷酸多態(tài)性是大腸息肉的一個(gè)易感因素[8]，Ibrahim等報(bào)道在應(yīng)用免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)從正常組織到增生，從腺瘤性大腸息肉到大腸癌中DNMT3B表達(dá)增加[9]。所以DNMT3B可能在腺瘤性大腸息肉的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要作用。Chen等報(bào)道在不同類型癌癥中，最顯著的是DNMT3B的過表達(dá)而不是DNMT3A和DNMT1過表達(dá)[10]。因此在腺瘤性大腸息肉中，DNMT的變化情況很可能是與癌癥相似：DNMT3B過表達(dá)。

腺瘤性大腸息肉發(fā)展成與大腸癌的幾率與其直徑密切相關(guān)，直徑1 cm以下的腺瘤性大腸息肉約有10%的病人發(fā)展成大腸癌，而直徑2 cm以上腺瘤性大腸息肉的病人約有50%的發(fā)展成大腸癌。本研究并沒有區(qū)分樣本直徑與DNMTs表達(dá)的關(guān)系，同時(shí)本研只是初步(7例腺瘤性大腸息肉和7例正常大腸粘膜)研究DNMT1、DNMT13A和DNMT13B在腺瘤性大腸息肉的發(fā)生和發(fā)展的作用。要明確DNMTs在腺瘤性大腸息肉的發(fā)生發(fā)展中的作用，特別是DNMT3B的作用，則需要增加研究樣本數(shù)和區(qū)分樣本直徑等更深入的工作。明確DNMT1、DNMT3A和DNMT3B各自在大腸息肉的發(fā)生和發(fā)展中的作用，特別是它們在抑癌基因甲基化中的作用，對于大腸息肉的治療有重要意義。

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