李銘臻 周冰燚 徐珊珊 蔡慧娜 鄧順美 鄭立新

(廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院 ，廣東 廣州 510600)

對(duì)Y染色體微缺失的研究始于1976年，Tiepolo等發(fā)現(xiàn)6例無(wú)精子癥患者Y染色體長(zhǎng)臂上有缺失，從而推斷在Y染色體上存在精子生成相關(guān)基因。1986年，無(wú)精子癥因子(AZF)被認(rèn)為集中在Yq11.23區(qū)域。1996年，AZF被定位于Yq11遠(yuǎn)端，從近到遠(yuǎn)的三個(gè)非重疊區(qū)依次為:AZFa、AZFb、AZFc。不同區(qū)域的缺失發(fā)生率和缺失的臨床表現(xiàn)不盡相同，尤其AZFc的缺失，部分患者表現(xiàn)為少精子癥，此類患者AZF的缺失有自然遺傳或通過(guò)IVF、ICSI垂直傳遞給下一代男性的風(fēng)險(xiǎn)。所以對(duì)需進(jìn)行輔助生育的男性進(jìn)行AZF的檢測(cè)，是非常有意義的。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

2009年7月～2012年6月到廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院門診就診，來(lái)自各地的不育癥男性，常規(guī)進(jìn)行精液檢查，并建議患者同時(shí)進(jìn)行AZF基因檢測(cè)。用一次性無(wú)菌注射器抽取受檢者靜脈血2ml，注入含EDTA-Na2的抗凝劑的真空管中，充分混勻，2小時(shí)內(nèi)置4℃保存待檢測(cè)。

1.2 檢測(cè)方法

AZF基因診斷試劑盒由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供，能同時(shí)檢測(cè)AZF 15個(gè)位點(diǎn)的缺失，分別是：AZFa(SY82、SY84、SY86)、AZFb(SY124、SY127、SY128、SY133、SY134、SY143)、AZFc(SY239、SY242、SY254、SY255)及AZFd(SY145、SY152)。嚴(yán)格按試劑盒、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)步驟和要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用試劑盒提取DNA試劑提取受檢者外周血DNA ，取DNA 2ul加入反應(yīng)管中，用PTC-200PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)立正常男性陽(yáng)性對(duì)照、正常女性的陰性對(duì)照及空白對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖在美國(guó)BIO-RID電泳儀上進(jìn)行110V，60分鐘水平電泳。經(jīng)美國(guó)Wealtec凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 結(jié)果判斷

AZF 15個(gè)位點(diǎn)中有一個(gè)或多個(gè)缺失的，判斷為AZF有缺失；AZFa的位點(diǎn)中有一個(gè)或多個(gè)缺失的，判斷為AZFa有缺失，如此判斷AZFb有缺失、AZFc有缺失和AZFd有缺失。

2 結(jié) 果

進(jìn)行AZF基因檢查的3712人，21-48歲，平均年齡31.3歲。經(jīng)基因診斷，AZFa有缺失的69例，缺失率1.86%(69/3712)；AZFb有缺失的196例，缺失率5.28%(196/3712)；AZFc有缺失的355例，缺失率9.56%(355/3712)；AZFd有缺失的366例，缺失率9.86%(366/3712)；AZF缺失的共405人，總的缺失率為10.91%(405/3712)，如表1所示。

表1 不育癥男性AZF各區(qū)缺失率

發(fā)現(xiàn)19種不同的缺失類型，最常見(jiàn)三種缺失類型所占全部缺失類型的84.20%，它們分別為：SY152+AZFc缺失180例，占44.44%(180/405)；AZFb+AZFc+AZFd缺失111例，占27.41%(111/405)；15個(gè)位點(diǎn)全缺失50例，占12.35%(50/405)，詳見(jiàn)表2。

表2 不育癥男性AZF缺失類型

注：“+”對(duì)應(yīng)的STS位點(diǎn)存在；“-” 對(duì)應(yīng)的STS位點(diǎn)缺失。

查閱9例SY152+AZFc缺失患者近一年內(nèi)的精液常規(guī)檢查結(jié)果，有多次檢查的K取其平均值。結(jié)果如表3所示。

表3 9例SY152+AZFc缺失患者精液情況

3 討 論

1976年，Tiepolo等發(fā)現(xiàn)6例無(wú)精子癥患者的Y染色體長(zhǎng)臂上均有缺失，從而推斷在Y染色體上存在精子生成相關(guān)基因[1]。1986年，無(wú)精子癥因子(AZF)被認(rèn)為集中在Yq11.23區(qū)域[2]。1992年，發(fā)現(xiàn)Y染色體基因片斷微缺失(microdeletion)，并命名為YRRM。1996年，AZF被定位于Yq11遠(yuǎn)端，從近到遠(yuǎn)的三個(gè)非重疊區(qū)依次為:AZFa、AZFb、AZFc。1999年，Kent-First等又提出：在AZFb與AZFc之間還有AZFd區(qū)[3]。根據(jù)以往報(bào)道的數(shù)據(jù)，AZF缺失發(fā)生率在不育男性的發(fā)生率有很大差異，約1～55%[4]。2001年，F(xiàn)oresta等總結(jié)了1992年-2000年期間發(fā)表的關(guān)于Y染色體微缺失的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在男性不育患者中，AZF微缺失的平均發(fā)生率為8.12%[5]。經(jīng)過(guò)分析我院3712名不育癥男性患者的AZF結(jié)果，得到AZF缺失率為10.91%(405/3712)，略高于黃建貞[5]總結(jié)的8.12%。因?yàn)槲以簽閷？漆t(yī)院，設(shè)有人類精子庫(kù)，可進(jìn)行供精人工授精，可能與不孕不育患者相對(duì)集中有關(guān)。盡管以往報(bào)道的AZF發(fā)生率差異較大，但有一共同規(guī)律[6]，缺失率從高到低依次為：AZFc>AZFb>AZFa。在不育癥男性當(dāng)中得到相同的結(jié)論，AZF缺失率：AZFc 9.56% > AZFb 5.28% > AZFa 1.86%。

AZFa的基因主導(dǎo)精母細(xì)胞的增生，AZFa缺失導(dǎo)致精子在青春期前發(fā)生阻滯，患者表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合癥；AZFb缺失導(dǎo)致在減數(shù)分裂前期或減數(shù)分裂中精子發(fā)生阻滯，多停留在精母細(xì)胞階段，患者常表現(xiàn)為生精阻滯[7、8]。AZFc編碼的蛋白質(zhì)主要存在精細(xì)胞形成的后減數(shù)分裂期(晚期精細(xì)胞和精子)，這可以說(shuō)明它在精細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄失活期具有后轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[9]。所以，AZFc缺失患者可能存在精子生成能力, 其他類型的缺失對(duì)精子生成的影響更為嚴(yán)重，均為無(wú)精子癥患者[5、10]。在表2中，我們所發(fā)現(xiàn)的19種缺失類型中，18種存在AZFa或AZFb中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)有缺失的患者，臨床均表現(xiàn)為無(wú)精子癥。唯獨(dú)SY152+AZFc缺失患者精液中有精子，臨床表現(xiàn)為少精子癥，占5%(9/180)，其余均為無(wú)精子癥。此類型的缺失不涉及AZFa、AZFb區(qū)，AZFc區(qū)的主要是對(duì)精細(xì)胞分化的后期轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，致其臨床表現(xiàn)為少精子癥或無(wú)精子癥。少精子癥患者有將AZF的缺失自然遺傳或通過(guò)IVF、ICSI垂直傳遞給下一代男性的風(fēng)險(xiǎn)[11]。對(duì)需進(jìn)行輔助生育獲得的男性進(jìn)行AZF的檢測(cè)，能為患者的診斷、治療及遺傳咨詢提供理論依據(jù)。

在15個(gè)所檢測(cè)的位點(diǎn)中，AZFa、AZFb、AZFd中的位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)缺失規(guī)律，但AZFc與此三個(gè)區(qū)不一樣，從所發(fā)現(xiàn)的19種缺失類型類來(lái)看，AZFc的四個(gè)位點(diǎn)SY239、SY242、SY254、SY255均為同時(shí)存在或同時(shí)缺失。此結(jié)果與2008年肖曉素[12]報(bào)道的一致，說(shuō)明AZFc四個(gè)位點(diǎn)之間關(guān)系緊密。目前，AZFd 區(qū)域是否真正存在還存在爭(zhēng)議[13]。AZFd區(qū)中的兩個(gè)位點(diǎn)SY145和SY152，兩者出現(xiàn)缺失的相關(guān)性不大，而SY152與AZFc關(guān)系更密切。從表2中可看到，除序號(hào)“6”的9例患者外，SY152均與AZFc同時(shí)存在或同時(shí)缺失。所以AZFd的存在意義及SY152的歸屬問(wèn)題有待進(jìn)一步探討。

[1] Tieplo L. Localization of factors controlling sperm atogenes is in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm[J]. Human Genet, 1973,34:119-123.

[2] Vergnaud G. A deletion map of the human Y chromosome based on DNA hybridization[J]. Am J Human Genet,1986,38:109-114.

[3] Kent-First M. Denfining regions of the Y chromosome responsible for male infertility and identification of a fourth AZF region(AZFd) by Y chromosome microdeletion detection[J]. Mol Reprod Dev,1999,53:27-41.

[4] MittalRD,SinIgh G,Srivastava A,et al.Y chromosome microdeletions in idiopathic in fertility from Northern India[J].Ann Genet 2004,47(4):331-337.

[5] 黃建貞, 翁蘭英.無(wú)精子因子(AZF)與男性原發(fā)性不育的相關(guān)關(guān)系[J]. 中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志2006,14(8):5-7.

[6] 何曉艷,王樹(shù)玉,賈嬋維.Y染色體微缺失與男性不育.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志.2005,13(5):115-116

[7] 鄺炎波,張暢斌,周慶葵,等.無(wú)精子癥和少精子癥不育患者Y染色體AZF微缺失檢測(cè)[J].中國(guó)性科學(xué).2008,17(6):3-6.

[8] 何南南, 孫瑩璞. 男性不育中Y染色體微缺失的研究進(jìn)展[J].生殖與避孕.2012, 32(7):482-485.

[9] 于海濤,岳麗玲.染色體微缺失與男性不育的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志.2006,14(2): 1-3

[10] 紀(jì)冬梅,馮云,李錚,等.810例嚴(yán)重少(無(wú))精子癥患者Y染色體微缺失篩查與分析[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志.2010,18(2):36-38.

[11] 萬(wàn)磊,蔡志明. AZFc區(qū)部分缺失與男性不育的關(guān)系[J].中華男科學(xué)雜志.2009,15(2):165-169

[12] 肖曉素,盧麗華,王晉,等. 無(wú)精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者Y染色體AZF微缺失及點(diǎn)突變的研究[J]. 中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志2008,16(10):13-15.

[13] 高云,陳嘉昌,彭煥玉,等.Y染色體微缺失及其檢測(cè)方法[J]. 分子診斷與治療雜志 2011,9(3):326-329.