高艷霞 賈鳳娟 吳炳江 楊國棟

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018； 2. 泰山醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271016)

植物在自然界生長發(fā)育過程中，經(jīng)常遭遇到生物和非生物脅迫因子的傷害。高溫脅迫是造成作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降的一個主要原因，而改善作物種子的抗高溫能力在生產(chǎn)上具有重要意義。

熱激蛋白(heat-shock protein,HSP)又稱熱休克蛋白或應(yīng)激蛋白，是細(xì)胞在應(yīng)激原(如高溫)刺激下所生成的一類蛋白質(zhì)[1]。HSP廣泛存在于各種生物體內(nèi)。當(dāng)植物受到高溫脅迫時，高溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子(HSF)會調(diào)控?zé)峒さ鞍装l(fā)生積累[1-2]。植物中的熱激轉(zhuǎn)錄因子首先在番茄中克隆到Hsfs基因[3]且目前多對番茄HsfAla、HsfA2和HsfB1進(jìn)行研究。李春光等[4]對擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA2進(jìn)行了抗熱和抗氧化脅迫等方面的研究，晁旭等[5]對擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA6a進(jìn)行了細(xì)胞定位及耐高溫功能分析等方面的研究，而對于擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA9的功能分析尚未見報道。因此，本研究以擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA9為目的基因，利用種子特異啟動子At2S3來研究熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA9在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能，為提高作物種子的耐高溫能力提供資料。

1 材料與方法

1.1植物材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana, Col)，生態(tài)型為哥倫比亞型Columbia(Col)，煙草NC89(Nicotiana tabacum NC89)為校園溫室的自交種子，為本實驗室所保存。培養(yǎng)條件：短日照為8h光照/16h黑暗，長日照為16h光照/8h黑暗；溫度：擬南芥為22℃，煙草為28℃。

1.2菌株與質(zhì)粒

本研究所用的大腸桿菌菌株為DH5α，根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，雙子葉植物雙元表達(dá)載體pBI121為本實驗室保存。pMD18-T Simple購于TAKARA公司。

1.3目的基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)Tair擬南芥信息資源網(wǎng)站上公布的AtHsfA9的基因組序列設(shè)計引物(5’-GGATCCACAAGAAATAGAAACGGTGTAGG-3’)和(5’-GAGCTCTTAGTAATGGAAGGCGATGGC-3’)，從擬南芥基因組中擴(kuò)增AtHsfA9目的基因，將其連接到克隆載體pMD18-T Simple上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行基因測序。測序正確后，提取質(zhì)粒，用BamH I和Sac I進(jìn)行酶切回收，獲得目的片段。將目的片段連接到表達(dá)載體pBI121上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，檢測目的條帶正確后，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101獲得工程菌株。

1.4煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

用含有目的基因的根癌農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)化煙草，在含有50 mg/L卡那霉素(Kan)的MS分化培養(yǎng)基及生長培養(yǎng)基來培養(yǎng)愈傷組織并得到轉(zhuǎn)基因苗。收獲的T0代種子用MS+50 mg/L卡那霉素(Kan)平板進(jìn)行篩選,10 d后挑選T1代陽性植株轉(zhuǎn)移到土中,提取基因組DNA，PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株。T2代選取卡那霉素(Kan)抗性3∶1分離的單基因插入株系,轉(zhuǎn)移到土中培養(yǎng)并收種子。T3代株系中卡那霉素(Kan)抗性不再分離的為單基因插入純合株系,用作熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA9在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析。

1.5轉(zhuǎn)基因煙草植株基因組DNA的提取和PCR

從每株上選取葉片，提取基因組DNA，PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株。用At2S35’引物(5’-CAAACAGTGTGTATACGTACAC-3’)和At2S33’引物(5’-GGATCCTGTTGTCGGGATTATG-3’)進(jìn)行PCR鑒定；PCR擴(kuò)增體系為25 μl，反應(yīng)步驟為：預(yù)變性：94℃ 5 min；循環(huán)條件：94℃ 30 s，50～60℃ 30 s，72℃ 1～2min；循環(huán)30次，后延伸：72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測是否有目的條帶，進(jìn)行下一步試驗。目的條帶是1872 bp。

1.6熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA9的表達(dá)分析

為了驗證熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA9是否響應(yīng)高溫這一非生物脅迫，我們對其進(jìn)行了高溫脅迫條件的誘導(dǎo)表達(dá)分析。將生長2周的WT(野生型擬南芥)于45℃分別熱激處理0.5 h，1 h，2 h，3 h，4 h和5 h，并以未作處理的WT作為對照組，用液氮進(jìn)行取材，然后提RNA，去除基因組，用PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用real-time PCR檢測其表達(dá)量。以EF1-α作為內(nèi)參，AtHsfA95’引物(5’-ACGGAGTTGATACCGAACA-3’)和AtHsfA93’引物(5’-TGTCAGGCTCGGGATTGTGTCAGGCTCGGG-3’)。

1.7轉(zhuǎn)基因煙草對高溫脅迫的根系生長試驗

將WT(煙草NC89)以及At2S3::AtHsfA9 L2，L3株系純合體種子消毒后鋪在MS培養(yǎng)基上，于4℃冰箱中成層處理，2 d后置于煙草培養(yǎng)箱中，豎直培養(yǎng)。其中，一批在正常培養(yǎng)條件下萌發(fā)，作為對照組；一批在45℃高溫脅迫下處理12 h后，再于正常培養(yǎng)箱中豎直培養(yǎng)。萌發(fā)5 d后，將三種植株轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，15 d后觀察其根長生長差異。

2 結(jié)果與分析

2.1目的基因片段和表達(dá)載體的鑒定

如圖1所示，構(gòu)建的克隆載體用BamH I和Sac I進(jìn)行酶切回收，得到1258 bp的目的基因片段(圖1,A)；將含有AtHsfA9的表達(dá)載體pBI121的大腸桿菌DH5α進(jìn)行菌液PCR鑒定，得到1258 bp的目的條帶(圖1,B)，與目的片段的大小一致，表明構(gòu)建的載體正確。

圖1 目的基因片段及其表達(dá)載體的鑒定

A：M：Marker 2000，1～2：2個重復(fù)擴(kuò)增的目的片段 B：M：Marker 2000，1～6：表達(dá)載體的菌液PCR

2.2轉(zhuǎn)基因煙草T3代株系的PCR鑒定

如圖2所示，利用At2S35’引物和AtHsfA93’引物來檢測轉(zhuǎn)基因煙草株系，得到超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因AtHsfA9 的PCR產(chǎn)物片段1872 bp(見圖2)，和預(yù)期相符，說明得到轉(zhuǎn)基因株系的純合體，可以進(jìn)行進(jìn)一步的功能分析。

圖2 At2S3::AtHsfA9轉(zhuǎn)基因煙草T3代株系的PCR鑒定

M：DNA Marker 2000；1～3：超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株

2.3熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA9響應(yīng)高溫脅迫

熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA9確實能響應(yīng)高溫這一非生物脅迫。結(jié)果如圖3所示，熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA9在45℃熱激時，其表達(dá)量開始上升。AtHsfA9在熱激處理0.5 h，1 h，2 h，3 h，4 h和5 h后，其表達(dá)量與未作處理的WT相比分別上升了4.5，6.2，15.0，34.6，27.0和10.4倍。

這個結(jié)果說明，對野生型擬南芥進(jìn)行熱激處理時，熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA9的表達(dá)量先升高后降低。在熱激處理3h時其表達(dá)量最高，與未熱激處理時相比提高了34.6倍。由此可知，高溫脅迫能不同程度的上調(diào)AtHsfA9的表達(dá)量(圖3)，說明AtHsfA9參與調(diào)控植物對抗高溫脅迫，熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA9確實能響應(yīng)高溫脅迫。如果在植物中利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)超表達(dá)AtHsfA9，則可使轉(zhuǎn)基因植物具有抗高溫及抗高溫能力，由此可以改良植物，提高植物對抗高溫脅迫的能力。

圖3 At2S3::AtHsfA9的誘導(dǎo)表達(dá)分析

AtHsfA9受到高溫脅迫條件的誘導(dǎo)，0h的表達(dá)量定義為1.0，以EF1-α作為內(nèi)參計算相對表達(dá)量。

2.4轉(zhuǎn)基因煙草的根系生長耐熱性分析

將WT(煙草NC89)和At2S3::AtHsfA9 L2、L3轉(zhuǎn)基因煙草株系純合體種子分別用70%的乙醇和2.6%的安替福民進(jìn)行消毒，用吐溫水洗5～6遍，鋪在MS培養(yǎng)基上，于4℃冰箱中成層處理，2 d后置于煙草培養(yǎng)箱中，豎直培養(yǎng)。其中，一批在正常培養(yǎng)條件下萌發(fā)生長，作為對照組；一批45℃熱激處理12 h后再置于正常培養(yǎng)箱中萌發(fā)生長。萌發(fā)5 d后，將幾種植株轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，15 d后觀察根系生長情況。試驗結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件下， At2S3::AtHsfA9轉(zhuǎn)基因株系的根長與WT相比縮短37%。在45℃熱激處理12 h后，轉(zhuǎn)基因株系和WT的根長與正常對照組相比均變短， At2S3::AtHsfA9轉(zhuǎn)基因株系的根長與WT相比縮短19%(圖4)。以上結(jié)果說明，超表達(dá)At2S3::AtHsfA9煙草株系的根系生長與WT相比對熱激處理呈現(xiàn)出更高的抗性。

圖4 At2S3::AtHsfA9根長試驗

3 討 論

非生物脅迫引起的應(yīng)答常常相互關(guān)聯(lián)而又非常復(fù)雜，比如植物細(xì)胞缺水有可能是由高溫、低溫、干旱、高鹽、重金屬等脅迫引起的，而缺水會使細(xì)胞的水分平衡紊亂，甚至于引起蛋白質(zhì)等大分子變性，破壞植物細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)等。植物在長期的演變進(jìn)化中產(chǎn)有多種多樣的抗逆性機(jī)制[6-7]。由于分子生物學(xué)的發(fā)展，植物抗逆機(jī)理已在基因組成、表達(dá)調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等分子水平上有所認(rèn)識[8-9]。細(xì)胞感受逆境信號，傳導(dǎo)逆境刺激，可以使植物激活一系列分子途徑，從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)和生理反應(yīng)，使植物在逆境中獲得抗逆性，其正常的生長發(fā)育從而得以維持[9-10]。 植物會通過各種途徑忍受或抵抗非生物脅迫，其中一個主要的方式是各種抗非生物脅迫基因的表達(dá)?；虮磉_(dá)受其上游啟動子及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，目前對抗非生物脅迫誘導(dǎo)啟動子順式作用元件及轉(zhuǎn)錄因子的研究成為熱點。

本試驗以擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA9為目的基因，來探討其在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能。從試驗結(jié)果上來看，熱激轉(zhuǎn)錄因子能在高溫脅迫條件下上調(diào)其基因表達(dá)量，說明熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA9有高溫脅迫抗性。同時本試驗第一次利用種子特異啟動子At2S3驅(qū)動熱激轉(zhuǎn)錄因子在種子中超表達(dá)，得到的轉(zhuǎn)基因煙草在種子的幼苗根長表現(xiàn)較高的抗高溫脅迫的能力。這一結(jié)果為種子特異啟動子可以在植物的早期發(fā)育時期發(fā)揮調(diào)控作用提供了依據(jù)，同時為種質(zhì)在分子生物學(xué)方法的改良奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1] Wang W, Vinocur B, Shoseyov O, et al. Role of plant heat shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends Plant Sci, 2004, 9: 244-252.

[2] Nakamoto H, Vigh L. The small heat shock proteins and their clients[J]. Cell Mol Life Sci, 2007, 64: 294-306.

[3] Scharf K D, Rose S, Zott W, et al. Three tomato genes code for heat stress transcription factors with a region of remarkable homology to the DNA-binding domain of the yeast HSF[J]. EMBO J, 1990, 9: 4495-4501.

[4] 李春光, 陳其軍, 高新起,等. 擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA2調(diào)節(jié)脅迫反應(yīng)基因的表達(dá)并提高熱和氧化脅迫耐性 [J].中國科學(xué)C輯：生命科學(xué), 2005, 48(6): 540- 550.

[5] 晁旭，王東平，鞏振輝，等.擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子耐高溫功能分析[J].西北植物學(xué)報,2007,27(7): 1305-1310.

[6] Xiong L, Schumaker K S， Zhu J K. Cell signaling during cold, drought, and salt stress[J]. Plant Cell, 2002, 14: 165-183.

[7] Hu H, You J, Fang Y, et al. Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt tolerance in rice[J]. Plant Mol Biol, 2008, 67:169-181.

[8] Gilmour DS, Thomas GH. Drosophila nuclear proteins bind to regions of alternating C and T residues in gene promoters[J]. Science, 1989, 254: 1487-1490.

[9] Thomashow MF. PLANT COLD ACCLIMATION: Freezing Tolerance Genes and Regulatory echanisms[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1999, 50, 571-599.

[10] Gilmour DS, Thomas GH. Drosophila nuclear proteins bind to regions of alternating C and T residues in gene promoters[J]. Science, 1989, 254: 1487-1490.