管 瑩，高 茜，朱洲海，米其利，李雪梅，繆明明，夭建華

（云南煙草科學研究院，云南 昆明650106）

微核試驗檢測終點明確，且方法簡便，易于開展，是遺傳毒性標準組合試驗之一。在食品、醫(yī)藥產品、工農業(yè)產品等與健康相關產品的安全評價、遺傳損害的監(jiān)測、特定人群的突變損傷檢測和早期預報等方面得到了廣泛的應用［1－4］。近30年來，以減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement）和替代（Replacement）為核心的3R理論已愈來愈多地被國際社會所接受，利用體外微核試驗對物質的毒性進行篩查，可有效地減少動物的使用量，是當今毒性測試發(fā)展的主要趨勢。體外微核試驗多采用哺乳動物細胞，為有核細胞，有核細胞微核的判定標準目前尚屬空白，對其的判定多借鑒《食品安全性毒理學評價程序》（以下簡稱標準1）［1］和《新藥臨床前安全性評價與實踐》（以下簡稱標準2）［5］，這兩種判定標準均是基于骨髓細胞微核試驗，骨髓細胞微核試驗采用的是嗜多染紅細胞，無核，微核明顯，容易觀察和判定。故對有核細胞的微核判定標準進行深入研究十分必要。

除此之外，體外微核試驗采用離體培養(yǎng)的細胞，完全脫離了整體穩(wěn)態(tài)和內分泌調控，其結果的穩(wěn)定性在很大程度上依賴于受試細胞本身，細胞自身的狀態(tài)對試驗結果的穩(wěn)定性具有重要影響。

因此，作者對已發(fā)現(xiàn)的影響微核試驗結果的關鍵因素判定標準和細胞連續(xù)傳代代次進行了深入研究，以期為提高哺乳動物細胞體外微核試驗結果的可重復性及可比性提供參考。

1 實驗

1.1 主要試劑與儀器

DMEM／F12、LHC－8細胞培養(yǎng)基，Invitrogen公司；胎牛血清，GIBCO公司；PBS、胰蛋白酶、細胞松弛素B，Sigma公司；環(huán)磷酰胺；甲醇（分析純）；Giemsa染料；二甲基亞砜（DMSO，細胞培養(yǎng)級）。

6孔細胞培養(yǎng)板，Corning公司；超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱，F(xiàn)orma公司；離心機；顯微鏡；SM450型自動吸煙機。

1.2 方法

1.2.1 細胞的傳代培養(yǎng)

按常規(guī)方法消化CHO細胞，制成單細胞懸液，調節(jié)細胞密度，接種到細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計為第1代細胞；待細胞匯合率達到80%時，按1∶4比例傳代，匯合率再次達到80%時計為第5代細胞；以此類推，連續(xù)傳代至第17代。

1.2.2 卷煙煙氣樣品的制備

按國標方法［6］，利用自動吸煙機抽吸20支標準測試用卷煙3R4F，用直徑92mm的劍橋濾片捕集燃吸后產生的煙氣總粒相物（TPM），稱重并計算TPM的量；將劍橋濾片放入三角瓶中，加入適量DMSO，置于超聲儀上超聲20min；用無菌濾紙過濾，收集TPM提取液，調節(jié)TPM在DMSO中的終濃度為10mg·mL－1；將樣品分裝后于－80℃儲存待用。

1.2.3 哺乳動物細胞體外微核試驗

按常規(guī)方法消化CHO細胞，制成單細胞懸液，以細胞計數儀計數后，將CHO細胞稀釋至5×104個·mL－1，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2mL；將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)24h；每批試驗設空白對照組、DMSO溶劑陰性對照組、環(huán)磷酰胺陽性對照組、樣品組，其中樣品組分別設定1／2IC50、1／4 IC50、1／8IC50、1／16IC504個濃度（IC50值由中性紅細胞毒性試驗測定）；移除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，將配制好的空白對照、陰性對照、陽性對照和不同濃度TPM樣品溶液添加到培養(yǎng)板中，每孔2mL，同時加入細胞松弛素B溶液，終濃度為6μg·mL－1；將培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；用胰蛋白酶溶液將細胞從培養(yǎng)板的表面消化下來；低滲后滴片；用新配制的Giemsa染液染色15min，自來水沖洗、風干，在普通光學顯微鏡下觀察1000個雙核細胞，計數微核的數量，計算微核率。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

利用統(tǒng)計學軟件SPSS，選擇雙樣本t－test方法對不同處理試驗組微核率之間是否有顯著性差異進行檢驗。

2 結果與討論

2.1 判定標準對受試物微核率的影響

以CHO細胞為受試細胞，對參比卷煙3R4F的TPM在1／2IC50、1／4IC50、1／8IC50、1／16IC504個劑量下的微核率進行檢測，分別參照標準1和標準2進行顯微鏡鏡檢，結果如圖1所示。

圖1 不同判定標準對誘發(fā)CHO細胞微核率計數結果Fig.1 Micronucleus rate of CHO cells according to different scoring criteria

由圖1可知，隨著受試劑量的增大，受試物的平均微核率呈上升趨勢，依據兩種判定標準對同一受試物不同劑量下的微核率計數結果均有顯著差異（P＜0.05），但劑量－微核率總體趨勢較為一致。這主要是由于標準1和標準2對微核的相對大小判定有所差異，標準1規(guī)定微核直徑為細胞直徑的1／20～1／5［1］，標準2規(guī)定小者如針尖，大者可達細胞直徑的1／3～1／2［5］。標準2對微核大小判定范圍較標準1寬，以其為判定準則對同一受試物誘發(fā)細胞微核率計數結果較高。由此可見判定標準對受試物誘發(fā)細胞微核率存在直接影響。此外，目前微核試驗主要依靠人工顯微鏡鏡檢，微核判定還存在著主觀差異［7］。因此，統(tǒng)一微核判定標準對提高體外微核試驗的可重復性及可比性是十分重要的。

由于兩種判定標準均是基于骨髓細胞微核試驗，屬于體內微核試驗，與本研究采用的CHO細胞體外微核試驗在試驗方法和細胞株的選擇上有所差異。通常體外微核試驗采用細胞分裂阻滯微核（Cytokinesisblock micronucleus，CB－MN）分析技術，計數一次核分裂后雙核細胞中的微核數，提高了微核識別的準確性。雖然CHO細胞為OECD哺乳動物體外微核試驗指導文件［8］中推薦使用的細胞株，但未對其微核大小有明確規(guī)定。研究人員應根據受試物的特性選擇適用判定標準。

2.2 細胞連續(xù)傳代代次對受試物微核率的影響

分別取第1、5、9、13、17代CHO細胞為受試細胞，對參比卷煙3R4F的TPM的平均微核率進行檢測，參照標準1進行微核率計數，結果如圖2所示。

圖2 不同代次CHO細胞體外微核率計數結果Fig.2 In vitro micronucleus rate of different passages CHO cells

由圖2可知，隨著細胞代次的升高，受試物平均微核率呈上升趨勢，第1代、第5代、第9代3個試驗組的微核率較為一致（P＞0.05），但與第13代和第17代2個試驗組的微核率有顯著差異（P＜0.05）。這表明，連續(xù)傳代9代以內的CHO細胞的微核率較為一致。

2.3 討論

細胞的狀態(tài)也是影響微核率的重要因素之一。有研究對多種癌細胞株與正常細胞株的微核率進行比較，發(fā)現(xiàn)癌細胞株微核率明顯高于正常細胞株［9］。正常細胞株經過長期培養(yǎng)后可自然癌化［9］，以老化的細胞作為檢測細胞必然會導致結果的假陽性率升高。

3 結論

由于判定標準選用的不同會導致體外微核試驗結果出現(xiàn)顯著差異，為了提高體外微核試驗結果的可重復性以及可比性，研究人員應根據受試物的特性選擇合適的判定標準；其次，應保證用于體外微核試驗的細胞狀態(tài)的穩(wěn)定，CHO細胞連續(xù)傳代代次控制在9代以內為佳。

［1］GB 15193－2003，食品安全性毒理學評價程序［S］.

［2］GB 15670－1995，農藥登記毒理學試驗方法［S］.

［3］YY／T 0127.12－2008，牙科學 口腔醫(yī)療器械生物學評價 第2單元：試驗方法 微核試驗［S］.

［4］SN／T 2178－2008，危險品哺乳動物紅細胞 微核試驗方法［S］.

［5］袁博俊，王治喬.新藥臨床前安全性評價與實踐［M］.北京：軍事醫(yī)學科學出版社，1997：102－108.

［6］GB／T 19609－2004，卷煙用常規(guī)分析用吸煙機測定總粒相物和焦油［S］.

［7］閆學昆，陳英，杜杰，等.CB微核法圖像自動分析技術研究進展［J］.輻射防護通訊，2008，28（5）：9－14.

［8］OECD Guideline for the testing of chemicals draft proposal for a new guideline 487：In vitro mammalian cell micronucleus test（MNvit）［S］.

［9］唐劍云，王相智，何博，等.不同類型細胞株的微核出現(xiàn)率［J］.安徽師范大學學報（自然科學版），1983，（1）：80－83.