周新木 陳麗榮

（1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科，杭州321000；2浙江省麗水市中心醫(yī)院病理科，麗水323000）

肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)、高發(fā)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)已經(jīng)成為惡性腫瘤的第2位的殺手。由于肝細(xì)胞癌易轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，預(yù)后差，如何能在肝細(xì)胞癌尚未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移前及早預(yù)測(cè)、診斷，并及時(shí)采取有效措施就成為能否進(jìn)一步提高肝細(xì)胞癌治療效果的關(guān)鍵。本研究采用免疫組織化學(xué)Envision法檢測(cè)谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase GS）、E－鈣粘蛋白（E－cad－h(huán)erin）和β－連環(huán)蛋白（β－catenin）在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，探討其與肝細(xì)胞癌臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。

材料和方法

1．一般資料

收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院和浙江省麗水市中心醫(yī)院2001年1月－2011年12月行肝細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本182例，及其相應(yīng)的癌旁肝組織標(biāo)本92例。全部病例均經(jīng)手術(shù)和病理證實(shí)，術(shù)前均未行放療或化療，具有完整的病理資料。所有標(biāo)本均經(jīng)40g／L緩沖中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。182例病例中男性143例，女性39例；年齡32－87歲，中位年齡58歲；腫瘤最大徑＜5cm 125例，腫瘤最大徑≥5cm 57例；高分化（Edmonson分級(jí)1－2）81例，低分化（Edmonson分級(jí)3－4）101例；脈管內(nèi)瘤栓定義為HE組織切片檢查于血管或淋巴管內(nèi)見(jiàn)癌細(xì)胞者，有脈管內(nèi)瘤栓55例，無(wú)脈管內(nèi)瘤栓127例；TNM分期Ⅰ和Ⅱ期117例，Ⅲ和Ⅳ期65例；肝外轉(zhuǎn)移29例（肺15例，椎體10例，肋骨2例，腎上腺1例，腦1例），肝內(nèi)轉(zhuǎn)移12例，無(wú)轉(zhuǎn)移141例；術(shù)后復(fù)發(fā)75例，術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)107例。

2．試劑

鼠抗人GS單克隆抗體（clone GS－6）購(gòu)自美國(guó)Chemicon International Inc．公司。即用型免疫組化EnVision試劑盒（試劑盒號(hào)87－8963SuperpictureTM 3rd Gen IHC Dettion Kit）購(gòu)自北京中杉公司。即用型鼠抗人E－cadherin（clone MAB－0589）和即用型鼠抗人β－catenin單克隆抗體（clone CAT－5H10）均購(gòu)自福州邁新公司。

3實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法，石蠟切片經(jīng)脫蠟，梯度酒精水化后，抗原熱修復(fù)，用3%雙氧水室溫孵育20min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，pH7．2磷酸鹽緩沖液沖洗，加入一抗（GS 1∶450；E－cadherin 1∶50；β－catenin 1∶50），37℃恒溫水箱孵育1h，PBS沖洗，滴加EnVisionTM通用型二抗50μl，置于37℃恒溫水箱孵育25－30min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片，鏡檢。所有抗體陰性對(duì)照以PBS代替第一抗體。E－cadherin和β－catenin抗體陽(yáng)性對(duì)照選擇已知陽(yáng)性標(biāo)本為對(duì)照。

4．結(jié)果判斷

GS結(jié)果判斷：GS陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒著色。采用二級(jí)計(jì)分法，首先按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；然后按陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：腫瘤細(xì)胞內(nèi)無(wú)陽(yáng)性染色者為0分，陽(yáng)性細(xì)胞率＜10%為0分，10%－25%為1 分，＞25%－50%為2分，＞50%－75%為3分，＞75%為4分。將二者相加得綜合免疫組化評(píng)分：≤3分為陰性，＞3為陽(yáng)性。E－cadherin和β－catenin結(jié)果判斷：于腫瘤細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核表達(dá)≥10%，稱為異位表達(dá)；不表達(dá)或細(xì)胞膜表達(dá)＜10%稱為細(xì)胞膜表達(dá)缺失；異位表達(dá)和細(xì)胞膜表達(dá)缺失統(tǒng)稱為異常表達(dá)，單純細(xì)胞膜表達(dá)為正常表達(dá)［1］，異常表達(dá)為陽(yáng)性，正常表達(dá)為陰性。免疫組化結(jié)果由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法讀片評(píng)定。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)；多樣本率的比較采用行χ列表資料的χ2檢驗(yàn)；參數(shù)間的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0．05為有顯著性差異。

結(jié) 果

1．肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中GS、E－cadherin、β－catenin的表達(dá)

GS在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中呈棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1），陽(yáng)性表達(dá)率為77．5%；癌旁肝組織表達(dá)率為4．3%，差異顯著（P＜0．05）。E－cadherin和β－catenin在癌旁肝組織呈棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞膜，異常表達(dá)率分別為30．4%和26．1%；肝細(xì)胞癌中則主要表現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞質(zhì)和或細(xì)胞核顯色（圖2，3），而細(xì)胞膜的顯色減少，表現(xiàn)為異位表達(dá)和表達(dá)缺失，異常表達(dá)率分別為59．3%和58．8%，與癌旁肝組織差異顯著（P＜0．05）（表1）。

2．肝細(xì)胞癌 GS、E－cadherin、β－catenin表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

GS在肝細(xì)胞癌TNM分期Ⅲ＋Ⅳ組的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ＋Ⅱ組，差異顯著（P＜0．05）；GS在肝外和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組中陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)轉(zhuǎn)移組，差異顯著（P＜0．05）；GS在術(shù)后有復(fù)發(fā)組中陽(yáng)性表達(dá)率高于術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)組，差異顯著（P＜0．05）；而與年齡、性別、腫瘤大小、分化程度和脈管內(nèi)瘤栓無(wú)關(guān)（P＞0．05）。E－cadherin和β－catenin異常表達(dá)與脈管內(nèi)瘤栓、TNM分期、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，差異顯著（P＜0．05）；而與年齡、性別、腫瘤大小和分化程度無(wú)關(guān)（P＞0．05）（表2）。

圖1 GS在肝細(xì)胞癌中陽(yáng)性表達(dá)（Envision×100）圖2 E－cadherin在肝細(xì)胞癌細(xì)胞質(zhì)異常表達(dá)（Envision×100）圖3 β－catenin在肝細(xì)胞癌細(xì)胞核異常表達(dá)（Envision×100）Fig．1Positive expression of GS in hepatocellular carcinoma（EnvisionTM×100）Fig．2Aberrant expression of E－cadherin in hepatocellular carcinoma cytoplasm（EnvisionTM×100）Fig．3Aberrant expression ofβ－catenin in hepatocellular carcinoma nucleus（EnvisionTM×100）

表1 肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中 GS、E－cadherin、β－catenin的表達(dá)Table 1 Expression of GS，E－cadherin，β－catenin in hepatocellular carcinoma and adjacent non－neoplastic liver tissue

表2 182例肝細(xì)胞癌中GS、E－cadherin和β－catenin的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 Correlation of GS，E－cadherin，β－catenin expression to clinicopathological characterisitics of 182patiens in hepatocellular carcinoma

3．肝細(xì)胞癌中 GS表達(dá)與 E－cadherin、β－catenin表達(dá)之間的關(guān)系

GS在肝細(xì)胞癌中與E－cadherin共表達(dá)90例（r1＝0．169），與β－catenin共表達(dá)89例（r2＝0．163），具有正相關(guān)性（P＜0．05）。

討 論

肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多因素影響、牽涉多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑的復(fù)雜過(guò)程。Wnt信號(hào)通路由Wnt蛋白及其受體、調(diào)節(jié)蛋白共同構(gòu)成，參與細(xì)胞的增殖、代謝和凋亡過(guò)程，并維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，其異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［2，3］。GS作為Wnt信號(hào)通路的靶基因，伴隨β－catenin的異常激活而導(dǎo)致許多人類疾病的發(fā)生。有研究報(bào)道，GS可作為AFP低水平表達(dá)的早期原發(fā)性肝癌的新的標(biāo)記物［4，5］。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌GS表達(dá)水平高于癌旁肝組織，并且與肝細(xì)胞癌TNM分期、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，臨床分期越高，蛋白表達(dá)程度越高，與Osada等研究基本一致［6，7］。提示GS在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，GS與惡性腫瘤細(xì)胞侵襲性密切相關(guān)，高表達(dá)可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是肝細(xì)胞癌中GS高表達(dá)，可以使腫瘤細(xì)胞不僅依賴宿主提供谷氨酰胺而自行合成，從而為腫瘤細(xì)胞合成核甘酸提供原料，有利于克服不利的生長(zhǎng)環(huán)境，而不斷增殖，進(jìn)而增強(qiáng)了腫瘤的生存能力。

E－cadherin／β－catenin細(xì)胞粘附復(fù)合體，與細(xì)胞骨架相連，在維持細(xì)胞間的正常粘附中起到重要作用，在上皮組織中強(qiáng)表達(dá)，主要位于同種上皮細(xì)胞膜上的細(xì)胞連接處。研究發(fā)現(xiàn) E－cadherin／β－catenin在很多腫瘤中相對(duì)于正常組織低表達(dá)，或稱為異位表達(dá)、缺失表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度相關(guān)［8－11］。本研 究 結(jié) 果 顯 示，E－cadherin／β－catenin 在肝細(xì)胞癌中異位表達(dá)、缺失表達(dá)（異常表達(dá)）高于對(duì)照組，且與脈管內(nèi)瘤栓、TNM分期、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，說(shuō)明 E－cadherin／β－catenin所代表的上皮標(biāo)志物的缺失，可能是肝細(xì)胞癌細(xì)胞獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制之一。

GS是β－catenin的靶基因，GS陽(yáng)性可以作為Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵點(diǎn)β－catenin突變的標(biāo)記，高表達(dá)與β－catenin基因變異或者是通路激活有關(guān)［3］。本研究顯示肝細(xì)胞癌GS高表達(dá)與E－cadherin／βcatenin異常表達(dá)呈正相關(guān)。其機(jī)制可能是：①βcatenin降解系統(tǒng)障礙，使其在細(xì)胞漿內(nèi)積聚，過(guò)多的β－catenin進(jìn)入細(xì)胞核，激活細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵通路的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路，由此引起細(xì)胞增殖，分化失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。而且胞質(zhì)內(nèi)β－catenin積聚還能導(dǎo)致下游靶基因GS轉(zhuǎn)錄激活，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。②β－catenin異位表達(dá)和E－cadherin的膜表達(dá)缺失均可導(dǎo)致E－cadherin和β－catenin不能形成復(fù)合物，上皮細(xì)胞間的黏附能力下降或喪失，使腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性增加［12］。

綜上所述，肝細(xì)胞癌中GS的高表達(dá)，與E－cadherin和β－catenin表達(dá)的下調(diào)，可能是肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，聯(lián)合檢測(cè)GS、E－cadherin和β－catenin可能有助于判斷肝細(xì)胞癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后分析。隨著對(duì)肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究的逐步深入，開(kāi)展 Wnt信號(hào)通路GS靶基因的基因診斷及治療，有可能為人類肝細(xì)胞癌及其他腫瘤的早期防治開(kāi)辟?gòu)V闊的前景。

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