張政科 ,虢清偉,顏智勇,龍 焰,岳 衡,許振成

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學環(huán)境工程系,湖南 長沙 410128；2.環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所,廣東 廣州 510655；3.暨南大學環(huán)境工程系,廣東 廣州 510632；4.南華大學市政工程系,湖南 衡陽 412001)

隨著城市的發(fā)展,城市河流及其生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生了巨大變化[1],混凝土、砌石等硬質(zhì)體護坡方式被廣泛應用于城市河道,導致水、河道與植被分隔,阻隔了水體與土體的交換和循環(huán),使很多河岸的植物喪失了生存空間,水生動物失去了生存和避難場所[2-5].這種硬質(zhì)體的護坡方式,只考慮了護堤,忽視了河道的生態(tài)環(huán)境效應,日漸被人們摒棄,建設生態(tài)型堤岸已成為大勢所趨.

沸石植生混凝土以沸石制成較高強度的多孔混凝土骨架,并在其連通的孔隙內(nèi)灌注泥土等供植物生長,既具有混凝土防護邊坡的功能,又有綠化環(huán)境、改善生態(tài)景觀和凈化水質(zhì)的功能.植生混凝土等生態(tài)護岸方法在國外已有較廣泛研究[6-8],近年來,國內(nèi)也陸續(xù)開展了植生混凝土的研究工作[9-10],并運用于諸多河道及湖泊的整治.沸石植生混凝土是本課題組開發(fā)的針對富營養(yǎng)化河流及湖泊的護坡材料,它由具高效氨氮吸附性能的沸石、土壤、植物和微生物組成,構(gòu)成一個“微型人工濕地”系統(tǒng),對水體中氨氮具有很高的處理效率.但對這個系統(tǒng)內(nèi)微生物群落缺乏足夠的認識.

PCR-DGGE技術(shù)是目前研究環(huán)境微生物多樣性及種群動態(tài)變化的有效手段[11],Muyzer等[12]1993年首次將其運用于環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的研究,PCR-DGGE技術(shù)已廣泛應用于人工濕地、江河沉積物、土壤、活性污泥等環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[13-16].本研究利用 PCR-DGGE技術(shù),以成型的沸石植生混凝土為研究對象,取沸石表面生物膜、孔隙土壤（取樣深度5～10cm）及根區(qū)土(10～15cm)三層,考察了濱水區(qū)與非濱水區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)特征,從而為揭示植生混凝土高效脫氮機理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采用沸石植生混凝土為研究對象,2011年 9月,以沸石為骨料制成多孔混凝土,再通過降堿、灌注適生材料(主要成分為塘泥、有機肥、緩釋肥)等工序,最后種植百喜草,待生長10個月后,于2012年7月選取其中長勢良好的植生混凝土用于模擬河道中試研究.

沸石植生混凝土均重 3.2kg,其中骨料(沸石)質(zhì)量為2kg,泥、水及植物質(zhì)量為1.2kg.基本構(gòu)造：下部為高10cm,直徑20cm的圓柱形混凝土構(gòu)件,上部為長勢良好的百喜草(株高 30～60cm),植物根系穿透多孔混凝土構(gòu)件,根長約 30cm,如圖 1所示.

1.2 樣品采集

于2012年8月采集位于模擬河道中的沸石植生混凝土樣品,分別取淺水區(qū)(濱水區(qū))和堤岸(非濱水區(qū))的沸石植生混凝土：沸石(刮取表面微生物膜)、孔隙土壤(采樣深度為5～10cm)、根區(qū)土壤(采樣深度為10～15cm)共6個樣品,對上述樣品進行 PCR-DGGE分子實驗研究,所有樣品經(jīng)冷凍干燥儀-80℃凍干后,研磨后過100目塞,樣品分裝放在-20℃下保存待分析[17].

1.3 主要儀器及試劑

儀器：EPS501型電泳儀(瑞典),ImageQuant 350(美國GE Health),Eppdorf 5331型PCR儀(德國),SIGMA 3K30臺式高速冷凍離心機(德國),BECKMAN J-6B冷凍離心機(美國BECKMAN公司),DU640核酸/蛋白分析儀(美國BECKMAN公司),The DcodeTM Universal Mutation system基因突變檢測系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司).試劑：Goldview染料購自廣州東盛生物公司;DGGE所用試劑均為Amresco或BBI分裝,購自上海生工公司.

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品總 DNA 提取 向樣品中加入5mLCTAB 提取液(100mmol/LTris·Cl, 100mmol/LEDTA-Na2, 200mmol/LNaCl, 2%CTAB, pH 8.0)中,37℃振蕩45min.加入20%SDS的至終濃度為2%,65℃水浴 2h.12000r/min,10min離心,收集上清.上清用等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)抽提2次,加入終濃度1/10體積的醋酸鈉(pH5.2)及0.6倍體積異丙醇,4℃沉淀 1h.12000r/min冷凍離心20min,收集沉淀,用70%乙醇洗滌2次,晾干后溶于 50μl TE(pH8.0).測定提取的總 DNA 濃度,用TE將其稀釋至100ng/μL.

1.4.2 16S rRNA基因V3區(qū)擴增 所用引物為細菌16SrDNA V3高變區(qū)F357和R518(表1),反應體系為 50μL 總體積,ddH2O 41.25μL,10×Buffer(含 2.0mmol/L MgCl2) 5μL,dNTP (10mmol/L)1μL,F357-GC(10μmol/L) 1μL,R518(10μmol/L) 1μL,Taq 酶(5U/μL) 0.25μl,模板 DNA 2μL.設置陰性對照.

反應程序：94℃ 5min預變性;20Cycles (94℃40s;65℃ 30s;72℃ 30s);15Cycles(94℃ 40s;55℃30s;72℃ 30s);72℃延伸10min.

陶貴周(1959-)，男，主任醫(yī)師，二級教授，研究方向：冠心病的基礎與臨床研究，尤其是冠心病的介入治療。

取 PCR 產(chǎn)物各 2μL,1.5%瓊脂糖凝加5%Goldview染液,1×TAE緩沖液,120V 穩(wěn)壓電泳25min,凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜,檢查擴增效果.

表1 細菌16S rDNA V3區(qū)引物Table 1 16S rDNA V3fragment primers of bacterium

1.4.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE) 采用D-Code突變檢測系統(tǒng)對濱水區(qū)、非濱水區(qū)的6個樣品進行DGGE分析.所用聚丙烯酰胺凝膠濃度為 8%(丙稀酰胺：雙丙稀酰胺=37.5：1),變性劑濃度從 40%～65%(100%的變性劑為 7mol/L 尿素,40%甲酰胺).在 70V電壓下,60℃恒溫,1×TAE中電泳14h.電泳完畢后,用超純水沖洗膠,然后將膠放進含 5%Goldview 的染液中,置于搖床上染色30min后,凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖譜.

1.4.4 DGGE電泳圖譜分析 采用 Quantity One軟件對 DGGE圖譜的泳道和條帶進行識別,Tolerance 設定為 2%,Rolling Size為 10,以達到最佳效果,分析不同樣品之間可能存在的聯(lián)系.用 Sorenson配對比較相似性系數(shù)(Cs),比較不同樣品 DGGE指紋圖譜的相似性,計算公式為：

式中：a、b表示兩個比較對象中的 DNA條帶數(shù)目;j表示a和b中相同的條帶數(shù)量.

多樣性指數(shù)(H),物種豐度(S)等指標被用來比較各個樣品的細菌多樣性.公式如下：

式中：pi是某個樣品中單一條帶的強度在該樣品中的所有條帶總強度中所占的比率;S是某個樣品中所有條帶數(shù)目總和.

1.4.5 切膠測序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析 選取具有代表性的條帶,切下完整的目標DGGE條帶,裝入1.5mL離心管中備用.回收DGGE條帶中的目標DNA,并以該DNA為模板梯度稀釋后做PCR擴增,并在廣東省微生物研究所完成基因測序.測序完成后,使用GenBank的BLAST程序?qū)⒛繕诵蛄信c NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對,獲得各個序列的同源性信息,并采用 ClustalX2.11和MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果

2.1 樣品DGGE圖譜

采用D-Code突變檢測系統(tǒng)對濱水區(qū)、非濱水區(qū)的6個樣品進行DGGE分析.圖2為不同樣品的DGGE指紋圖及不同位置的切膠編號.圖2右邊為DGGE圖譜條帶分布和相對強度示意.

圖2 樣品的DGGE圖譜及不同位置的切膠編號Fig.2 DGGE electrophoretic image of different samples and plastic cutting number of different locations

2.2 微生物群落相似性和多樣性分析

2.2.1 微生物群落相似性分析 依據(jù)建立的泳道條帶識別圖(圖2),可以比對各個泳道擁有的條帶,從而計算出各個樣品間的相似性系數(shù) Cs.各樣品相似系數(shù)如表2所示,1#和4#相似度最低,僅為 33.4%,2#和 6#相似度最高,達到了 67.2%,說明濱水區(qū)沸石表面生物膜和堤岸根部 2個樣品中微生物存在明顯的差異,而堤岸沸石表面生物膜和濱水區(qū)孔隙土這 2個樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)相似程度比較高.

2.2.2 物種豐度和微生物多樣性 根據(jù)Quantity One軟件中得到的數(shù)據(jù)計算各樣品的Shannon指數(shù)（H）結(jié)果如表3所示,其中,6個樣品的物種豐度和多樣性指數(shù)差別不大,2#樣品的多樣性指數(shù)和物種豐度最高,4#樣品最低.

表2 不同處理樣品相似性系數(shù)Cs(%)Table 2 The similarity coefficients of different samples(%)

表3 不同樣品中細菌多樣性指數(shù)(H) 和物種豐度(S)Table 3 The Shannon index and species abundance value of different samples

2.3 微生物族群歸屬分析

采用 Quantity One分析軟件,通過UPGMA算法(非加權(quán)平均算法)對6個樣品進行聚類分析.

圖3 樣品的DGGE聚類分析Fig.3 Cluster analysis of bacterial community of different samples based on the DGGE banding patterns

從聚類分析結(jié)果(圖 3)可以看出 2#～6#樣品聚在一簇,1#樣品單獨為一簇,兩簇之間相似度較低,相似性僅為0.41.其中,2#與6#樣品中微生物族群相似性最高為0.67.

2.4 基因測序結(jié)果及系統(tǒng)進化樹分析

選取圖2中具代表性的條帶,對編號為1、7、9、15、16、18、19、20、25、27的條帶進行測序,將所得到的序列與 NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對,獲得各個序列的同源性信息,構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 4).系統(tǒng)進化樹中相應種屬微生物代表了沸石植生混凝土中較明亮的條帶,為沸石植生混凝土內(nèi)部的優(yōu)勢菌群[18].它們分別與Staphylococcus epidermidis(葡萄球菌屬的epidermidis)、Flavobacterium(黃桿菌屬)、Paenibacillus(芽孢桿菌目Paenibacillaceae科Paenibacillus屬)、Cronobacter dublinensis(都柏林克羅諾桿菌)、Salmonella(沙門氏菌屬)、Bradyrhizobiumsp.(慢生根瘤菌屬)、Rhodopseudomonassp. (紅假單胞菌屬)、Agromyces(微球菌亞目的Microbacteriaceae科的Agromyces屬)、Acidobacteria(酸桿菌屬) 、Propionibacterium(丙酸桿菌屬)具有較高的序列相似度.

圖4 沸石植生混凝土中細菌的系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of various bacteria in zeolite-vegetation-concrete

3 討論

3.1 DGGE圖譜分析

從電泳結(jié)果(圖2)可以看出,沸石植生混凝土中生物多樣性指數(shù)很高,但各部分條帶數(shù)目和優(yōu)勢菌群存在一定的差異.其中,沸石表面生物膜（即1#和2#泳道）和孔隙土壤（即5#和6#泳道）樣品中亮帶較多,根部10～15cm（即3#和4#泳道）亮帶較少;堤岸根部 10～15cm（4#泳道）樣品中細菌種類最少,堤岸沸石表面生物膜（2#泳道）樣品中種類最多,說明微生物群落結(jié)構(gòu)隨著環(huán)境條件的變化而變化[18],微生物主要活躍在 10cm以上表層土壤,且微生物附著于沸石表面生長旺盛,而到根部10～15cm深度微生物豐度和多樣性均有所下降.

3.2 微生物豐度與多樣性分析

由表 3可知,沸石植生混凝土系統(tǒng)內(nèi)部微生物豐度值很高,樣品中產(chǎn)生的條帶最少為 35條,最多為 45條,這比陳永華等[19]研究人工濕地微生物多樣性的結(jié)果(樣品中平均為 25個條帶)要高出很多.濱水區(qū)和堤岸的植生混凝土內(nèi)部微生物多樣性指數(shù)及物種豐度總體持平,但是微生物在各層的分布情況不同,濱水區(qū)微生物多樣性指數(shù)及物種豐度值：孔隙土(根部 5～10cm)＞根部(10～15cm)＞沸石表面生物膜;堤岸微生物多樣性指數(shù)及物種豐度值：沸石表面生物膜＞孔隙土(根部 5～10cm)＞根部(10～15cm).這是由于系統(tǒng)內(nèi)沸石、植物、水等綜合因素所致.沸石表面能供微生物附著,提供一個載體,利于微生物掛膜生長;植物根系能夠泌氧[20-23],增加孔隙土(根部5～10cm)和根部(10～15cm)的溶解氧;而水有兩方面作用：一方面是水的傳質(zhì)作用,相比岸上在水溶液中微生物能更快吸收水中的營養(yǎng)元素,這有利于微生物的生長,另一方面是溶解氧的影響,在水面下溶解氧要低于岸上,不利于好氧微生物生長.由于水對于沸石植生混凝土系統(tǒng)內(nèi)的微生物生長起著正反兩方面作用,水的傳質(zhì)作用,使得濱水區(qū)微生物豐度要高于非濱水區(qū);而溶解氧的影響卻使濱水區(qū)微生物要低于非濱水區(qū),但是植物根系的泌氧作用使這方面的影響在根區(qū)(孔隙土和根部10～15cm)削弱.所以濱水區(qū)根部微生物豐度及多樣性指數(shù)要高于非濱水區(qū),而在沸石表面生物膜中微生物分布相反.

3.3 基因測序與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

由基因測序結(jié)果可知,濱水區(qū)和非濱水區(qū)以及它們內(nèi)部各部分間的微生物構(gòu)成各不相同.在濱水區(qū)沸石混凝土中,沸石表面微生物膜中優(yōu)勢菌種為丙酸桿菌、都柏林克羅諾桿菌和葡萄球菌屬,其中丙酸桿菌屬厭氧菌,能進行丙酸型發(fā)酵分解有機物,是厭氧污泥中常見細菌[24];孔隙土(根部 5～10cm)中優(yōu)勢菌種為黃桿菌和沙門氏菌屬,其中黃桿菌[25]是一種典型的反硝化細菌;根部10～15cm 中優(yōu)勢菌種為慢生根瘤菌屬[26],它屬革蘭氏陰性菌,利用銨鹽、硝酸鹽等作為氮源,能固定大氣氮到結(jié)合態(tài)氮(氨)供寄主植物所利用;非濱水區(qū)沸石混凝土中,沸石表面微生物膜中優(yōu)勢菌種為芽孢桿菌和紅假單胞菌屬,孔隙土(根部5～10cm)中優(yōu)勢菌種為沙門氏菌、微球菌亞目的Agromyces和酸桿菌屬,根部 10～15cm 中優(yōu)勢菌種為沙門氏菌屬.其中假單胞桿菌[27]和芽孢桿菌屬[28]被證明具有反硝化作用,它們廣泛存在于自然界中,是污水處理中不可缺少的微生物[29].這些微生物均使得沸石植生混凝土具有良好的凈化水質(zhì)功能,特別是脫氮作用,沸石植生混凝土內(nèi)部能夠穩(wěn)定進行反硝化反應.

4 結(jié)論

4.1 沸石植生混凝土內(nèi)部微生物豐度值很高,在非濱水區(qū)微生物豐度由高到低排列為：沸石表面生物膜＞根部 5～10cm＞根部 10～15cm;濱水區(qū)：根部5～10cm＞根部10～15cm沸石表面生物膜.

4.2 濱水區(qū)、非濱水區(qū)及沸石植生混凝土各層微生物群落差異明顯,相似度不高,各樣品間相似性系數(shù)在33.4%～67.2%之間.

4.3 濱水區(qū)和非濱水區(qū)沸石植生混凝土內(nèi)部物種多樣性指數(shù)及豐度總體持平,但局部差異明顯.

4.4 基因測序結(jié)果顯示,沸石植生混凝土中優(yōu)勢菌種為葡萄球菌、黃桿菌、芽胞桿菌、都柏林克羅諾桿菌、沙門氏菌、慢生根瘤菌、紅假單胞菌、微球菌亞目的Agromyces、酸桿菌、丙酸桿菌屬,這些微生物對沸石植生混凝土凈化水質(zhì)功能具有重要影響.

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致謝：本實驗樣品的預處理過程中得到了東江水環(huán)境研究中心(惠州站)所有工作人員的支持,在論文修改過程中,得到了閻佳博士的悉心指點,在此表示感謝.