肖 莉，劉 春，向世鵬，彭晚霞

（1.衡南縣煙草公司，衡陽市煙草公司煙草科學(xué)研究所，湖南 衡陽 421001；2.衡陽師范學(xué)院 生命科學(xué)系，湖南 衡陽 421008；3.中國煙草中南農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，湖南 長沙 410128；4.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125）

金屬毒性是影響作物產(chǎn)量的一個(gè)主要脅迫因子。包括植物必需的金屬，如銅、鐵、鋅、錳，和非必需金屬，如鎘、鋁、鈷、汞。高濃度的鋁、銅、鎘或汞等金屬對(duì)植物的一個(gè)主要且普遍的影響是抑制根的生長。金屬毒性能觸發(fā)活性氧的積累從而導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的損傷。植物對(duì)金屬毒性的響應(yīng)涉及幾個(gè)需要在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平被精確調(diào)控的生物過程。microRNAs（miRNAs）是一種小的，類似于siRNA的分子，由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過和靶基因mRNA的堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或阻礙其翻譯。miRNAs在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在植物、動(dòng)物和真菌中發(fā)現(xiàn)的miRNAs只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá)，miRNA的組織特異性和時(shí)序性，決定了組織和細(xì)胞的功能特異性，表明miRNA在細(xì)胞生長發(fā)育和生物與非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。

1 植物對(duì)金屬毒性的響應(yīng)

隨著人類活動(dòng)對(duì)地球生態(tài)系統(tǒng)的影響加劇，植物不斷暴露于眾多的非生物和生物脅迫中。一種重要的非生物脅迫是金屬毒性。重金屬如銅（Cu）、鐵（Fe）和鋅（Zn）對(duì)于植物生理和生化過程來說是必需的，而鎘（Cd）、鈷（Co）、汞（Hg）和鋁（Al）等則不是必需的。然而，高濃度的任何金屬類型對(duì)植物都是有毒的。

根尖是根最敏感的部位，因此Al、Cu、Cd和Hg等金屬的毒性主要表現(xiàn)在抑制根的生長［1］。植物對(duì)金屬毒性的響應(yīng)和處理包括合成參與脫毒的多種蛋白質(zhì)，如金屬硫蛋白（Metallothionein）、植物螯合肽（Phytochelatin）和谷胱甘肽（Glutathione），它們具有選擇性和高親和力重金屬結(jié)合位點(diǎn)。根分泌檸檬酸、草酸、蘋果酸和組氨酸等有機(jī)酸至根際是一個(gè)重要的生理響應(yīng)，因?yàn)檫@些復(fù)合物能與重金屬形成復(fù)合物從而脫毒［2］。

幾種金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)對(duì)于金屬毒性耐受性是必需的。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP－binding cassette）家族介導(dǎo)Al和Cd的轉(zhuǎn) 運(yùn)［3］。NRAMP（natural resistance－associated macrophage protein）家族能對(duì)Cd、Mn和Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行調(diào)控［4］。CDF（cation diffusion facilitator）家族參與二價(jià)金屬陽離子的細(xì)胞質(zhì)分泌和液泡隔離，從而在Zn、Cd、Co、Ni或Mn等金屬脫毒方面起作用［5］。已把源自P型ATP酶離子泵系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與Cu、Zn、Cd和Pb等重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)體聯(lián)系起來［6］。

金屬毒性脅迫會(huì)觸發(fā)活性氧（ROS）的積累，抗氧化酶類的活性被這種脅迫上調(diào)而失去平衡［7］。氧化脅迫導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的損傷。

植物對(duì)非生物脅迫如金屬毒性的響應(yīng)涉及轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)的精確調(diào)控。調(diào)控可以通過來自MYB、bZIP、ERF和WRKY等 不 同 家 族 的 轉(zhuǎn) 錄 因 子 而 實(shí) 現(xiàn)［5，8－10］。已在生長素調(diào)控基因—parA等金屬響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域鑒定出順式作用元件，parA在煙草（Nicotiana tabacum）中參與對(duì)Cd的響應(yīng)［11］。已在來自綠藻（Chlamydomonas reinhardtii）的糞生素氧化酶和細(xì)胞色素c6基因的啟動(dòng)子中鑒定出具有共有序列GTAC的銅響應(yīng)元件（CuRE）［12］。來自Phaseolus vulgaris的PvSR2基因的兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域含有重金屬響應(yīng)元件（HMREs）［13］。

小和／或大的非蛋白質(zhì)編碼RNAs（npcRNAs）可能參與金屬毒性響應(yīng)的調(diào)控／信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［14］。研究得最多的一類npcRNAs是microRNAs（miRNAs）。miRNAs是21個(gè)核苷酸的npcRNAs，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控植物的基因表達(dá)。具不完美的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre－miRNA）被加工成成熟的miRNA并整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）中從而啟動(dòng)與其堿基互補(bǔ)的靶mRNA（s）的降解／清除［15］。雖然在擬南芥中鑒定出的大部分miRNAs與植物的發(fā)育有關(guān)，但有證據(jù)表明miRNAs在植物響應(yīng)包括金屬毒性在內(nèi)的不同非生物脅迫方面也發(fā)揮作用［16］。

2 響應(yīng)金屬毒性的miRNAs及其靶標(biāo)

對(duì)暴露于金屬毒性下的植物的小RNAs表達(dá)譜的分析表明miRNA及其靶標(biāo)是差異表達(dá)的，從而揭示了它們?cè)谡{(diào)控／信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的可能作用。為確定特異miRNA的作用，對(duì)其靶標(biāo)的功能以及它們與金屬毒性響應(yīng)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間可能的互作分析是重要的。大部分響應(yīng)金屬毒性的保守性miRNAs的預(yù)測靶標(biāo)是一些主要參與植物發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子（表1）。某種miRNA的上調(diào)導(dǎo)致其靶標(biāo)的降解可能表明靶標(biāo)作為對(duì)金屬毒性響應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)子而起作用。最近高通量基因組技術(shù)和其他遺傳學(xué)途徑拓展了我們有關(guān)miRNAs的現(xiàn)有知識(shí)，以及它們?cè)趲追N植物響應(yīng)金屬毒性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的靶標(biāo)［17－20］。

表1 響應(yīng)金屬毒性的miRNAs

關(guān)于響應(yīng)Cd毒性的miRNAs：miR160、miR164和miR167以及新的Osa－miR602和Osa－miR604，已從暴露于Cd的水稻幼苗的小RNAs庫中鑒定出來［17］。Osa－miR602在暴露于高Cd濃度下12小時(shí)的水稻根部中被上調(diào)，它的預(yù)測靶標(biāo)是木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化酶／水解酶。Osa－miR604在用毒性水平的Cd處理6小時(shí)后的葉片中被上調(diào)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（LPT）被下調(diào)［17］。這類蛋白質(zhì)響應(yīng)環(huán)境脅迫并被認(rèn)為參與角質(zhì)和蠟質(zhì)的組裝以及植物對(duì)病原菌的防御［21］。水稻微陣列數(shù)據(jù)顯示在Cd脅迫下miR528被上調(diào)，而miR162、miR166、miR171、miR390、miR168和miR156家 族 被 下調(diào)［18］。搜索可能的響應(yīng)金屬的順式作用元件揭示了一個(gè)類MRE序 列（5’－TGCGCNC－3’）存 在 于 大 多 數(shù) 響 應(yīng)Cd的miRNA基因的啟動(dòng)子區(qū)域［18］。與不同非生物脅迫相關(guān)的其他順式作用元件如ARE（anaerobic－responsive element）、ABRE（ABA－responsive element）、GARE（gibberellins－responsive element）、ERE（ethylene－responsive element）、HSE（heat stress－responsive element）和LTR（low temperatureresponsive element）等也發(fā)現(xiàn)存在于這些miRNA基因的啟動(dòng)子中，從而暗示這些miRNAs可能響應(yīng)除金屬毒性以外的其他脅迫信號(hào)［18］。暴露于Cd下8小時(shí)后的油菜根中的miR393、miR171、miR156和miR396被下調(diào)［22］。

暴露于Cd、Hg和Al 24小時(shí)后的模式豆科植物Medicago truncatula葉子中的miR393、miR171、miR319和miR529被上調(diào)，而miR166和miR398被下調(diào)［23］。一高通量小RNA測序方法揭示在對(duì)Al的響應(yīng)中miR159、miR160、miR319、miR396和miR390被下調(diào)［19］。新近利用類似方法的一項(xiàng)研究在Medicago truncatula鑒定出了響應(yīng)Hg毒性的miRNAs如miR167、miR172、miR169、miR164、miR395家族被上調(diào)，而miR396、miR390和miR171被下調(diào)。此外，在M.truncatula中鑒定出一個(gè)新的響應(yīng)Hg的miRNAs如靶向編碼TIR－NBSLRR病抗性蛋白轉(zhuǎn)錄因子的miR2681［20］。

有關(guān)不同植物響應(yīng)金屬的miRNAs的現(xiàn)有信息揭示了miR319、miR390、miR393和miR398具有普遍的相關(guān)作用。

3 miR319、miR390、miR393和miR398的作用

3.1 miR319

植物的生長和衰老是受金屬毒性影響的過程［24］。幼苗對(duì)Al和Cu毒性的常見反應(yīng)包括葉片細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)的改變，光合活性的降低導(dǎo)致葉片黃化和壞死，總的葉片數(shù)量和大小降低，以及幼苗的生物量減少［25］。此外，Cu毒性會(huì)導(dǎo)致葉片的快速衰老。有趣的是，miR319及其靶標(biāo)TCP（Teosinte Branched／Cycloidea／PCF）轉(zhuǎn)錄因子（表1），涉及生長調(diào)控，在大多數(shù)響應(yīng)金屬毒性的miRNAs研究中已被證明是差異化表達(dá)的。結(jié)合啟動(dòng)子元件的TCP家族成員對(duì)于增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）基因的表達(dá)是必需的［26］。其他的TCPs參與幼苗側(cè)生器官形態(tài)發(fā)生［27］。近來，已證明miR319在葉片衰老方面起作用，該作用是通過茉莉酸生物合成和重要的衰老正調(diào)控子如WRKY53來正調(diào)控涉及葉片衰老的TCPs實(shí)現(xiàn)的［28］。

圖1描述了miR319和TCP的作用模式。在葉片中，高Cd、Hg和Al誘導(dǎo)的miR319導(dǎo)致TCP的降解從而影響生長和衰老。在根中，miR319在對(duì)Al的響應(yīng)中被抑制但在對(duì)Mn毒性的響應(yīng)中被誘導(dǎo)［19，29］。當(dāng)土壤中兩種金屬都豐富時(shí)，Al可能對(duì)Mn的吸收發(fā)揮拮抗作用從而減輕Mn毒性［30］。目前沒有有關(guān)當(dāng)植物根暴露于Al和Mn組合時(shí)miR319調(diào)控的報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)于這個(gè)問題的推測是困難的，因?yàn)樵谥参镏刑禺愖饔脤⒁蕾囉诮饘贊舛?、暴露時(shí)間、環(huán)境條件等幾個(gè)變量。

圖1 對(duì)金屬毒性的響應(yīng)中miR319、miR393和miR398的作用模式圖

3.2 miR390

在不同植物中的miR390及其靶標(biāo)TAS3（表1）均表現(xiàn)出與響應(yīng)金屬毒性有關(guān)。miR390誘導(dǎo)的TAS3轉(zhuǎn)錄本的切割起始ta－siRNAs（trans－acting small inter－ference RNAs）的生物發(fā)生，導(dǎo)致在側(cè)根發(fā)育中起關(guān)鍵作用的ARFs（auxin response factors）的降解［31］。在Cd、Hg和Al毒性下植物根中的miR390被抑制，而使完整的TAS3轉(zhuǎn)錄本積累和tasiARFs的減少，最終導(dǎo)致抑制側(cè)根的生長（圖1）［20］。

暴露于高Cu下的擬南芥植株顯示減少了主根的生長而增加了短側(cè)根的密度。同樣，在暴露于Cu下的植株中觀察到其主根和次生根根尖中有絲分裂活性、生長素和細(xì)胞因子在積累方面的改變［1］。我們可以推測miR390及其靶標(biāo)可能也響應(yīng)Cu毒性，但目前沒有有關(guān)Cu脅迫響應(yīng)中存在miR390調(diào)控的信息。

3.3 miR393

miR393受Cd、Hg和Al毒性的誘導(dǎo)［22－23］。這些金屬在葉片中誘導(dǎo)產(chǎn)生miR393，這將導(dǎo)致其靶標(biāo)F－box生長素受體TIR1／AFBs和bHLH轉(zhuǎn) 錄 因 子 受 到 抑 制（表1）［32］。TIR1正調(diào)控生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，miR393的增加導(dǎo)致生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制從而使TIR1處于較低的水平。研究顯示miR393在葉片發(fā)育、根系形態(tài)建成和根的生長方面起著重要的調(diào)控作用（圖1）［33］。這個(gè)miRNA也響應(yīng)Pseudomonas syringae細(xì)菌感染和鹽分脅迫［32］。

根是受土壤中高濃度金屬影響的主要器官，常見的表型響應(yīng)是株型的改變［34］。在這樣的響應(yīng)中miR393和miR390可能起了相關(guān)的調(diào)控作用。

3.4 miR398

miR398是在受氧化脅迫的調(diào)控中鑒定出的第一個(gè)miRNA，其靶標(biāo)是Cu／Zn超氧化物歧化酶（CSD）酶類：胞質(zhì)CSD1和膜CSD2如COX5b.1、線粒體細(xì)胞色素氧化酶的5b亞基（表1）。CSDs是清除超氧自由基從而釋放分子氧和過氧化氫的酶類［35］。CSD2mRNA序列與miR398的互補(bǔ)序列位于編碼序列內(nèi)而CSD1和COX5b.1轉(zhuǎn)錄本在5’UTR中含miR398互補(bǔ)序列［36］。

miR398啟動(dòng)子含有響應(yīng)Cu的具有重要特征的GTAC序列［37］。這一模序能被SPL7轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別，該轉(zhuǎn)錄因子能結(jié)合miR398并調(diào)控miR398的表達(dá)。此外，這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子也調(diào)控其他Cu相關(guān)miRNAs如miR397、miR408和miR857等的表達(dá)［38］。GTAC啟動(dòng)子序列也出現(xiàn)在其他重要的Cu響應(yīng)基因如在Cu缺乏下能增強(qiáng)Cu吸收能力的CPX1（coproporphyrinogen oxidase）和Cyc6（cytochrome 1c6）中［12］。

氧化脅迫抑制miR398的表達(dá)對(duì)于CSD1和CSD2轉(zhuǎn)錄本的積累是必不可少的（圖1）。暴露于Cu2＋和Fe3＋［16］等重金屬下miR398被下調(diào)，Cu2＋和Fe3＋能參與Fenton式反應(yīng)且有產(chǎn)生羥自由基的潛力［39］。此外，miR398在對(duì)強(qiáng)光和甲基紫精的響應(yīng)中被下調(diào)，此時(shí)CSD1和CSD2的轉(zhuǎn)錄本水平通常是增加的［16］。

過表達(dá)miR398前體的共抑制轉(zhuǎn)基因品系顯示在幼苗發(fā)育和脂質(zhì)過氧化速率方面對(duì)Cu2＋和MV脅迫的耐受性增強(qiáng)［16］。相反，一些報(bào)道指出同時(shí)過表達(dá)miR398b和miR398c是可能的且過表達(dá)品系表現(xiàn)出降低了CSD1和CSD2水平，但COX5b.1、mRNA和蛋白質(zhì)水平?jīng)]受影響［40］。

蔗糖是miR398表達(dá)的一個(gè)重要信號(hào)，它正調(diào)控miR398的積累。蔗糖水平與CSD1和CSD2蛋白質(zhì)水平相一致，但COX5b.1的水平隨著蔗糖水平的增加而降低。通過蔗糖而增加的miR398水平在存在和缺乏Cu的情況下都能維持，因此蔗糖和Cu對(duì)miR398的調(diào)控是獨(dú)立的［40］。

最近鑒定出超氧化物歧化酶（SOD）的Cu分子伴侶是miR398的一個(gè)靶標(biāo)，當(dāng)Cu缺乏時(shí)它的mRNA切割是受miR398介導(dǎo)的［41］。Beauclair等（2010）［41］認(rèn)為通過miR398的SOD調(diào)控能響應(yīng)未改變的CSD1和CSD2的蛋白質(zhì)水平，該蛋白質(zhì)水平是在表達(dá)抗miR398形式的CSD1或CSD2的植物研究中出現(xiàn)的［40］。

顯然，非生物脅迫如Cu2＋、Fe3＋、強(qiáng)光、MV、臭氧、鹽分和生物脅迫的共用信號(hào)是ROS的積累。ROS的產(chǎn)生和活性抗氧化酶類的合成均是對(duì)金屬毒性的一個(gè)普遍反應(yīng)。特異響應(yīng)的miR398或其他ROS響應(yīng)的miRNAs可能會(huì)根據(jù)金屬種類和暴露于金屬脅迫下的時(shí)間而變化（圖1）。

4 結(jié) 論

通過對(duì)響應(yīng)不同金屬毒性的miRNAs的分析和鑒定，表明它們參與植物適應(yīng)這些非生物脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。由此我們可以預(yù)測更多新的響應(yīng)金屬脅迫的miRNAs的存在。為深入理解miRNAs及其靶標(biāo)、以及闡明其作為植物響應(yīng)環(huán)境改變的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一的機(jī)理，進(jìn)一步的研究是必要的。而且我們應(yīng)當(dāng)考慮不同植物物種生長習(xí)性和基因型背景的差異而可能存在對(duì)金屬脅迫差異響應(yīng)的miRNAs。暴露于金屬下的時(shí)間長短、金屬的不同濃度和不同種類金屬的組合誘導(dǎo)的miRNAs及其靶標(biāo)動(dòng)力學(xué)的詳細(xì)研究將有助于我們深刻理解miRNAs在脅迫調(diào)控中的詳細(xì)作用機(jī)制，這將有助于設(shè)計(jì)出增強(qiáng)作物脅迫耐受性的更好的策略。

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