周樹萍 宗憲磊 綜述 牛扶幼 劉林嶓 蔡景龍 審校

皮膚是人體最大的器官，也是人體的第一道天然屏障，由表皮、真皮、皮下組織及其附屬器組成。皮膚具有保持自身結(jié)構(gòu)和正常生理狀態(tài)穩(wěn)定的能力。研究表明，皮膚更新的動(dòng)態(tài)平衡是由表皮干細(xì)胞（Epidermal stem cells，ESCs）增殖和分化之間的平衡決定的。ESCs是各種表皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，是皮膚不斷自我更新的源泉。近年來，ESCs的研究取得了積極進(jìn)展，本文就ESCs定位、標(biāo)記物、特性、調(diào)節(jié)機(jī)制及其應(yīng)用前景等研究現(xiàn)狀及進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 定位研究

ESCs并非隨機(jī)地分布于皮膚組織中，而是有著與它自己本身結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)聯(lián)的空間布局模式。一是表皮增殖單位，即表皮細(xì)胞呈相互獨(dú)立的垂直六角形的微細(xì)組織單位，每單位由居于其基底層中心的一個(gè)表皮干細(xì)胞、基底層上層的八到十個(gè)短暫擴(kuò)充細(xì)胞及最上層的多個(gè)定向細(xì)胞或終末分化細(xì)胞組成；二是網(wǎng)狀峪模式，即通常認(rèn)為的表皮干細(xì)胞位于表皮的基底層。

2006年，Moore等[1]發(fā)現(xiàn)，ESCs來源于胚胎的外胚層，是皮膚組織中的專能干細(xì)胞，是一種成年組織干細(xì)胞，具有增殖并分化成表皮中各種細(xì)胞維持皮膚正常表皮結(jié)構(gòu)，及在一定誘導(dǎo)條件下表現(xiàn)出胚胎干細(xì)胞性能的雙向分化能力，是一種潛在的多能干細(xì)胞。2008年，王聯(lián)群等[2]通過對Ⅳ膠原快速分選的ESCs進(jìn)行免疫熒光檢測，觀察到ESCs位于表皮基底層，均表達(dá)β1整合素、角蛋白19和P63，且隨著年齡不同其含量和分布有所差別，如β1整合素、角蛋白19和P63在胎兒表皮基底層細(xì)胞中均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在少兒表皮基底層細(xì)胞中大部分表達(dá)且陽性細(xì)胞均勻分布，而在成人表皮基底層細(xì)胞中則呈弱陽性表達(dá)且陽性細(xì)胞散在分布。2012年，Dahl等[3]發(fā)現(xiàn)，成人ESCs主要位于表皮細(xì)胞龕、皮脂腺和毛囊的隆突區(qū)域，這些ESCs能夠發(fā)育成表皮的各種細(xì)胞，更新死亡的表皮、皮脂腺和毛囊，其中，毛囊干細(xì)胞是ESCs的主要來源，毛囊隆突部是ESCs的主要分布部位，對毛囊的生長和新陳代謝，對表皮損傷后的修復(fù)均具有重要的作用。

研究表明，不同部位的ESCs功能是不同的。Jensen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮脂腺至毛囊間的區(qū)域存在一群LRIG1（抑癌基因）陽性的細(xì)胞，這些細(xì)胞在裸鼠皮膚重建過程中，不僅能發(fā)育成毛囊和皮脂腺，還能發(fā)育成表皮。Plikus等[5]發(fā)現(xiàn)，毛囊部存在ESCs，且在毛囊隆突部區(qū)域的ESCs負(fù)責(zé)補(bǔ)充毛發(fā)再生，而在毛囊峽部的ESCs（漏斗部和毛囊之間的交界處）主要負(fù)責(zé)表皮和皮脂腺的再生。

2 標(biāo)志物研究

ESCs可通過表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，目前用于ESCs分離鑒定的表面標(biāo)志物眾多。Eckert等[6]報(bào)道利用鑒定干細(xì)胞的標(biāo)記物，能夠鑒定干細(xì)胞在表皮內(nèi)的特殊區(qū)域，了解這些細(xì)胞在正常表皮的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和組織應(yīng)激條件中的作用。

研究表明，目前ESCs的分選方法主要為，一是根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)分選，采用流式細(xì)胞儀鑒定分選細(xì)胞表面的干細(xì)胞標(biāo)記物，包括整合素 α6、整合素 β1、CD71、CD49、CD34、CD 133、P63[7-9]；二是通過角質(zhì)干細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的差速黏附進(jìn)行分選；三是密度梯度離心法。

在ESCs研究中，目前應(yīng)用最多的表面標(biāo)志物主要有整合素β1、角蛋白19、核蛋白P63等[2]，其他標(biāo)記物還有 CD71、PCNA、Oct4、Nanog、C8/114B 以及 CD34 等[10]。

賴麒等[11]通過激光共聚焦顯微鏡，將組織切片進(jìn)行1 μm厚的斷層掃描，發(fā)現(xiàn)在ESCs和短暫擴(kuò)增的細(xì)胞表面整合素β1呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，而在終末分化細(xì)胞表面整合素β1不表達(dá)，認(rèn)為整合素β1是區(qū)分ESCs與短暫擴(kuò)增細(xì)胞及終末分化細(xì)胞的主要表面標(biāo)志物。

Inoue等[12]通過免疫組化及流式細(xì)胞分選等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞角蛋白 19（CK19）和細(xì)胞角蛋白 15（CK15）是 ESCs的陽性標(biāo)志物。Inoue等在研究干細(xì)胞的分化過程中，發(fā)現(xiàn)CK15表達(dá)的減少較CK19表達(dá)的減少更早，認(rèn)為CK15陰性而CK19陽性的細(xì)胞可能是“早期”短暫增殖細(xì)胞，因此認(rèn)為CK15在鑒別毛囊隆突部ESCs方面可能比CK19更有意義。2012年Nanashima等[13]認(rèn)為毛囊干細(xì)胞標(biāo)志物是CK15和CD34，未分化角質(zhì)化細(xì)胞的標(biāo)志物是CK5。

Oster[14]認(rèn)為，p63是具有調(diào)節(jié)并放大細(xì)胞增殖分化信號作用的一種蛋白質(zhì)，在ESCs生物性能的維持和增殖分化方面起著決定性作用。Choi等[15]在研究透明質(zhì)酸寡糖增加表皮細(xì)胞干細(xì)胞特性的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，p63基因的表達(dá)也增加了，間接表明p63是ESCs的標(biāo)志物之一。

Oct4基因是POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，主要表達(dá)于胚胎干細(xì)胞、生殖干細(xì)胞以及未分化胚胎癌中，對于維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性和自我更新功能具有極其重要的作用，因此對于來源于胚胎干細(xì)胞的ESCs，Oct基因在其保持多潛能性和自我更新中起著同樣重要的作用。Zhang等[16]在研究Wnt/β-catenin信號在體內(nèi)外對表皮細(xì)胞去分化的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，在活化劑誘導(dǎo)下Oct4的表達(dá)增高，細(xì)胞呈現(xiàn)干細(xì)胞特性。

Nanog基因是近年來在胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，該因子對維持ES細(xì)胞的自我更新起著關(guān)鍵作用，不僅能夠促進(jìn)ES細(xì)胞的自我更新，保持ES細(xì)胞的未分化特性，而且能夠使終末分化細(xì)胞進(jìn)行增殖活動(dòng)[17-18]。研究表明，在ESCs中Nanog基因的表達(dá)呈現(xiàn)陽性，因此可以通過檢測Nanog的活性及含量來檢測ESCs。

3 特性研究

ESCs屬于未分化細(xì)胞，具有未分化細(xì)胞的特性，表現(xiàn)為細(xì)胞體積小，細(xì)胞核大而胞漿少，核漿比例大，細(xì)胞內(nèi)RNA含量低，細(xì)胞器較少且不成熟，在組織結(jié)構(gòu)中位置相對固定。此外，它還具有三個(gè)典型的基本特性，即自我更新能力、慢周期性和黏附特性。

ESCs具備自我更新能力，通過有絲分裂，增殖產(chǎn)生新的ESCs和分化產(chǎn)生子代角質(zhì)細(xì)胞，參與皮膚代謝，產(chǎn)生新的表皮[19]。ESCs這種自我更新與分化潛能是其維持著整個(gè)表皮組織的穩(wěn)態(tài)。ESCs能夠進(jìn)行均衡的無分化和有分化的分裂，ESCs的增殖和分化之間的平衡維持著皮膚內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

研究表明，ESCs存在靜止期和活化期兩種細(xì)胞[20]，成體ESCs和毛囊干細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)均衡的或單向的命運(yùn)：①分化，最終從組織中消失；②均衡更新，自我更新。Oshimori等[21]研究認(rèn)為，休眠的ESCs和下面的間質(zhì)真皮乳頭之間傳遞信息，產(chǎn)生充足的激活信號，超過抑制性的BMP信號，毛囊再生開始，ESCs在毛發(fā)生長和皮膚創(chuàng)傷后被活化和遷移；Frances等[22]研究證實(shí)毛囊間ESCs和皮脂腺前體細(xì)胞是兩種具有單一分化潛能的干細(xì)胞，分別維持它們各自的組織穩(wěn)態(tài)。

離體培養(yǎng)時(shí)，ESCs呈克隆性生長，如進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，ESCs可進(jìn)行140次分裂，即能產(chǎn)生1×1040個(gè)子代細(xì)胞，這一特性對維持表皮的再生和長期動(dòng)態(tài)平衡具有重要意義。Zhang等[23]報(bào)道，從小鼠觸須部毛囊的隆突部取得一個(gè)毛囊干細(xì)胞，通過單克隆培養(yǎng)后得到了足夠數(shù)量的毛囊干細(xì)胞，并移植到了裸鼠背部，發(fā)育成了新的毛囊。

ESCs具有慢周期性（Slow cycling），即ESCs在體內(nèi)表現(xiàn)為標(biāo)記滯留細(xì)胞（Label-retaining cell），如在新生動(dòng)物細(xì)胞分裂活躍時(shí)加入氚標(biāo)的胸苷，由于ESCs分裂緩慢，因而可長期探測到放射活性，以保證其巨大的增殖潛能。Fuchs等[24]在干細(xì)胞的慢周期性的研究中，研究了毛囊干細(xì)胞在增殖與分化之間的平衡關(guān)系，發(fā)現(xiàn)毛囊干細(xì)胞具有慢周期性，同時(shí)是降低DNA復(fù)制時(shí)出錯(cuò)幾率的關(guān)鍵。

ESCs的另一個(gè)顯著特點(diǎn)是對基底膜的黏附。研究表明，ESCs主要通過表達(dá)整合素（Integrins）實(shí)現(xiàn)其對基底膜各種成分的黏附功能。干細(xì)胞對基底膜的黏附是干細(xì)胞維持其特性的基本條件，干細(xì)胞對基底膜的脫黏附是誘導(dǎo)干細(xì)胞脫離干細(xì)胞群落，進(jìn)入分化周期的重要調(diào)控機(jī)制之一。

4 調(diào)節(jié)機(jī)制研究

干細(xì)胞具有多向分化潛能，周邊微環(huán)境對其增殖、分化有重要調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間及各種細(xì)胞因子均構(gòu)成對干細(xì)胞分化的調(diào)控，其調(diào)節(jié)機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，一直是研究的重點(diǎn)和需要解決的難題。ESCs的分化增殖調(diào)節(jié)機(jī)制也是如此，目前的研究還在初步階段。

微環(huán)境，包括外在因素、生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間通信等，對于細(xì)胞命運(yùn)有重要影響。受到外部信號的影響，角質(zhì)化細(xì)胞協(xié)同其他種類的細(xì)胞調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合過程中的創(chuàng)面微環(huán)境。Lin等[25]的研究表明，TGF-β信號通路在毛囊中不同干細(xì)胞群的增殖、分化和編程性細(xì)胞死亡中起到重要作用；Connelly[26]證實(shí)了ESCs與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用具有調(diào)節(jié) ESCs 的終末分化作用；Martínez-Martínez 等[27]的臨床和實(shí)驗(yàn)研究顯示，延遲愈合的創(chuàng)面感覺神經(jīng)分布減少，認(rèn)為感覺神經(jīng)分布可能在創(chuàng)面愈合過程中對毛發(fā)干細(xì)胞的生理學(xué)起到功能性作用；Doles等[28]研究認(rèn)為，老化對細(xì)胞因子和干細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有破壞作用，干細(xì)胞會(huì)隨著老化而衰退，影響老年人的皮膚損傷修復(fù)；Li等[29]報(bào)道了ESCs向創(chuàng)面遷移在創(chuàng)面愈合過程中起到重要作用，內(nèi)源性的電場出現(xiàn)于創(chuàng)面，ESCs表現(xiàn)出明顯的趨電性，以調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合；賴麒等[11]綜述近年來文獻(xiàn)認(rèn)為，ESCs的增殖分化受到壁龕及Wnt信號通路、MAPK、c-Myc、Notch信號傳導(dǎo)通路、細(xì)胞因子等的調(diào)控；Firestone等[30]研究認(rèn)為,要使干細(xì)胞按照需要分化為特定的細(xì)胞株，需要有選擇地活化特定信號通路，使特定靶基因表達(dá)，并通過表觀遺傳機(jī)制維持相應(yīng)的細(xì)胞表型狀態(tài)。

近期研究發(fā)現(xiàn)，成人皮膚表皮中存在不連續(xù)的多個(gè)ESCs群，存在于皮膚的不同位置，稱為細(xì)胞龕，能分化成不同的細(xì)胞譜系，維持著表皮不同部分的再生。但是，每個(gè)干細(xì)胞群在生理?xiàng)l件下的確切作用還不清楚，調(diào)控ESCs的增殖和分化的精確機(jī)制尚不清楚。研究表明，毛囊濾泡膨脹部的干細(xì)胞可短暫擴(kuò)增表皮類的后代細(xì)胞，參與初期的再上皮化；位于毛囊峽部的干細(xì)胞群體，產(chǎn)生長效后代細(xì)胞，修復(fù)創(chuàng)面表皮，產(chǎn)生新的濾泡間ESCs；位于膨出部的干細(xì)胞補(bǔ)充毛囊譜系，位于峽部的干細(xì)胞再生濾泡間上皮和皮脂腺。近期研究顯示，毛囊干細(xì)胞對皮脂腺譜系和染色體畸變具有重要作用、micro-RNAs(miRs)對ESCs更新和分化具有調(diào)整作用[31]，黑色素干細(xì)胞存在于毛囊的膨脹部，皮膚干細(xì)胞分化為有功能的表皮黑色素細(xì)胞，可以調(diào)整皮膚的色素含量[32]?？傊ㄟ^譜系研究可以了解干細(xì)胞分布及其后代，從而利于研究ESCs的生物學(xué)特性[33-35]。

近年來，一些動(dòng)物模型系統(tǒng)的建立，例如人源化的小鼠或體外器官培養(yǎng)，促進(jìn)了人皮膚維持和重建，以及表皮再生的研究。這些動(dòng)物模型可用于譜系示蹤實(shí)驗(yàn)，采用遺傳學(xué)的方法改良細(xì)胞類型，進(jìn)行人干細(xì)胞的研究，了解皮膚干細(xì)胞群的位置、微環(huán)境及其重要性，探討干細(xì)胞的命運(yùn)和再生潛能的關(guān)鍵調(diào)整因素[36]。

5 應(yīng)用研究

付小兵等[37]提出了ESCs可成為實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面由解剖修復(fù)到功能修復(fù)飛躍的新策略，經(jīng)過十余年的研究更加證明了這一認(rèn)識(shí)的重要性。ESCs具有多向分化潛能、自我更新能力和高度的增殖能力，在創(chuàng)面功能修復(fù)、皮膚組織工程、皮膚遺傳病治療等方面的作用日益顯現(xiàn)。

研究創(chuàng)面愈合延遲和過度增生的機(jī)制及應(yīng)對措施并用于臨床，是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的重要任務(wù)之一[38]。當(dāng)皮膚受到損傷時(shí)，特別是大面積深度燒傷時(shí)，由于毛囊和汗腺等皮膚附屬器嚴(yán)重受損而影響傷者的生活質(zhì)量，近年來細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展為臨床應(yīng)用ESCs治療大面積皮膚損傷帶來了希望。如創(chuàng)面愈合的標(biāo)志是創(chuàng)面的上皮化，ESCs在創(chuàng)面上皮化中具有重要作用，成為目前的研究熱點(diǎn)。隨著ESCs研究的深入，應(yīng)用ESCs促進(jìn)創(chuàng)面愈合、治療增生性瘢痕以及瘢痕疙瘩有著廣闊的應(yīng)用前景[39]。Zhang等[23]報(bào)道即使是單個(gè)毛囊也能夠提供研究所需的毛囊干細(xì)胞，來自于毛囊膨脹部的干細(xì)胞高表達(dá)基底層標(biāo)志物CK14、整合素α6、P63和CK15，將其移植于裸鼠背部，長期體內(nèi)培養(yǎng)，GFP標(biāo)記的毛囊干細(xì)胞形成新的毛囊、表皮和皮脂腺，說明毛囊干細(xì)胞對治療皮膚損傷和疾病有潛在的應(yīng)用前景。Plikus等[35]研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)ESCs池，提出了表皮再生醫(yī)學(xué)，即當(dāng)皮膚損傷時(shí)，位于表皮中的ESCs就會(huì)在內(nèi)外因素的調(diào)控下，增殖分化成相關(guān)細(xì)胞，以修復(fù)機(jī)體損傷的表皮。Ghadially報(bào)道加快對ESCs的了解可能有助于改善患者的治療[40]。但是，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷無瘢痕愈合等問題仍需更深入的研究。

研究和制備出與皮膚結(jié)構(gòu)和功能一致的皮膚替代物，一直是皮膚組織工程的研究方向，ESCs可作為皮膚組織工程的種子細(xì)胞，在皮膚組織工程研究中具有重要作用。董麗等[41]報(bào)道，采用以Ⅳ型膠原和成纖維細(xì)胞聯(lián)合修飾的同種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)為支架，與ESCs復(fù)合后制備的組織工程皮膚具有表皮和真皮雙層結(jié)構(gòu)，可滿足全層皮膚替代物的基本組織學(xué)要求；楊青等[42]通過對體外分離培養(yǎng)的ESCs和毛囊干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者均可作為皮膚組織工程的種子細(xì)胞，而毛囊干細(xì)胞較ESCs更具優(yōu)勢。

隨著基因研究的深入，基因治療的臨床應(yīng)用進(jìn)入到一個(gè)新的階段。ESCs的基因治療包括導(dǎo)入標(biāo)志性基因或一個(gè)異源基因，使細(xì)胞內(nèi)原有基因過度表達(dá)，或誘導(dǎo)某個(gè)基因的突變等，可用于治療皮膚基因性疾病。如交界型大皰性表皮松解癥（JEB）是由于表皮基底膜內(nèi)的層黏連蛋白5基因突變所致，Mavilio等[43]把表達(dá)層黏連蛋白 5β3(LAM5-bata3)的基因片段整合到病毒載體形成cDNA，再將其轉(zhuǎn)移到LAM5-bata3缺陷的JEB患者的ESCs內(nèi)并進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后再將這些培養(yǎng)傳代的細(xì)胞移植到患者病變部位，1年隨訪發(fā)現(xiàn)移植部位皮膚完好，沒有發(fā)生水皰、感染、炎癥及免疫排斥反應(yīng)，并且移植部位新生的表皮更新是由基因轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞維持的，這表明ESCs的基因治療是可取的。

Su等[44]通過對敲除小鼠的p63基因研究發(fā)現(xiàn)，小鼠皮膚出現(xiàn)過早衰老、水皰、潰瘍，因此可知ESCs通過調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和基因組的穩(wěn)定性，從而防止過早的組織老化。

6 結(jié)語

ESCs是維持皮膚新陳代謝的主要功能細(xì)胞，是皮膚及附屬器發(fā)生、分化的搖籃。ESCs能主動(dòng)參與創(chuàng)面修復(fù)，促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化，在很多皮膚性疾病的治療、皮膚干細(xì)胞的組織工程學(xué)療法、基因治療中都有很好的應(yīng)用前景。但是目前尚有許多問題亟待解決，如定義干細(xì)胞的分子標(biāo)記物、祖細(xì)胞亞群的分子標(biāo)記物，確定干細(xì)胞的位置、不同譜系干細(xì)胞的環(huán)境對ESCs增殖和分化的調(diào)節(jié)通路等方面[41]，應(yīng)進(jìn)一步加快對ESCs的研究，使得ESCs更好地應(yīng)用于臨床。

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