鄧展?jié)?章文文 綜述 易龍 審校

（南京大學(xué)，江蘇南京 210046）

法洛四聯(lián)癥與FOG2基因研究進(jìn)展

鄧展?jié)?章文文 綜述 易龍 審校

（南京大學(xué)，江蘇南京 210046）

法洛四聯(lián)癥（TOF）是最常見(jiàn)的發(fā)紺型先天性心臟病，發(fā)病率為1／3000，占所有先心病的10%，嚴(yán)重危害患兒健康。FOG2基因編碼一種富含鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，與轉(zhuǎn)錄因子GATA4相互作用調(diào)控心臟錐干的發(fā)育。FOG2基因敲除的小鼠擁有類TOF樣的心臟畸形，被認(rèn)為是TOF的一種易感基因。TOF的形成和錐干發(fā)育異常有關(guān)，研究證實(shí)FOG2基因突變可以導(dǎo)致TOF。對(duì)ZFPM 2／FOG2基因的研究可以幫助我們了解法洛四聯(lián)癥的病因，也可能促進(jìn)法洛四聯(lián)癥的基因診斷和基因治療。

法洛四聯(lián)癥；FOG2基因；GATA4

法洛四聯(lián)癥（tetralogy of fallot，TOF）是最常見(jiàn)的復(fù)雜先心病，新生兒發(fā)病率為1／3000，占先心病的10%［1］。TOF包括4種最基本的病理改變：主動(dòng)脈騎跨、室間隔缺損、肺動(dòng)脈狹窄和右心室肥大。TOF的臨床表現(xiàn)嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致死亡，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，通過(guò)安置人工補(bǔ)片外科治療大大提高了TOF患兒的生存率。然而，0.5%～6%的患兒術(shù)后由于室性心動(dòng)過(guò)速而猝死。事實(shí)上，即使缺口得到修復(fù)，用于修復(fù)的補(bǔ)片可能會(huì)引起心臟變形，影響右心室的正常收縮功能［2］。

組織學(xué)上，TOF是胚胎心臟發(fā)育神經(jīng)嵴細(xì)胞相關(guān)的錐干發(fā)育缺陷，第二心區(qū)心前細(xì)胞增殖、遷移和分化異常所致［3］。該區(qū)域含有表達(dá)GATA4蛋白的心前細(xì)胞，細(xì)胞遷移到原始心管的動(dòng)脈極，影響錐干的發(fā)育和心肌壁的形成［4］。

迄今為止，TOF的病因仍然不清楚，一般分為遺傳類和非遺傳類的。非遺傳類的原因有環(huán)境致畸因子、孕前感染以及感染性疾?。?］。盡管數(shù)十年來(lái)，國(guó)際上專注于預(yù)防這些因素，但是這些非遺傳類因素種類越來(lái)越多而且更加多樣化。先心病的基因研究狀況同樣也發(fā)生了變化。最初的遺傳研究方法只有很低的分辨率，分析先心病的遺傳形式受到了限制?？紤]到先心病高死亡率和低生育率的比例，故早期的先心病的家系分析，都是偏向于簡(jiǎn)單的畸形，比如室間隔缺損（V SD）和房間隔缺損（A SD）。但隨著先心病患者健康狀況的改善和基因組研究技術(shù)的發(fā)展，消除了對(duì)研究對(duì)象的局限。當(dāng)代的技術(shù)為先心病患者進(jìn)行廣泛的基因分析提供了豐富的機(jī)會(huì)，研究發(fā)現(xiàn)一些基因的突變與TOF的形成有關(guān)。

1 ZFPM 2／FOG2基因的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)以及編碼蛋白

GATA轉(zhuǎn)錄因子是在哺乳動(dòng)物中造血（GATA-1／2／3）和心臟發(fā)生（GATA4）中重要的調(diào)節(jié)因子。GATA蛋白通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用共同調(diào)控GATA蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。Friend of GAT A4（FOG）是一種能與GATA1相互作用并能調(diào)控GATA1的轉(zhuǎn)錄活性的鋅指蛋白，1999年，Svensson等［7］在小鼠中克隆出另外一種FOG相關(guān)蛋白基因（FOG2基因）。他們發(fā)現(xiàn)FOG2基因編碼的FOG2蛋白位于8q22，含8個(gè)外顯子，包含1151個(gè)氨基酸，擁有8個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，在結(jié)構(gòu)上與FOG蛋白高度同源。在小鼠的胚胎中，F(xiàn)OG2基因最先在心臟和膈肌中表達(dá)，隨后，該基因廣泛表達(dá)于小鼠的心臟、大腦和睪丸組織中。該研究組實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示小鼠FOG 2基因可以參與調(diào)節(jié)不同的中胚層細(xì)胞譜系的分化，并且在心臟發(fā)育過(guò)程中起到明顯的調(diào)節(jié)作用。

2 FOG2基因的表達(dá)和功能以及人類心臟的形成

1999年，Svensson等［7］研究發(fā)現(xiàn)小鼠FOG2蛋白能在體內(nèi)和體外與GATA4的N端鋅指特異性相結(jié)合。通過(guò)特異性結(jié)合，F(xiàn)OG2能調(diào)節(jié)GATA4的轉(zhuǎn)錄活性，因?yàn)樵谛∈笈咛コ衫w維細(xì)胞和大鼠的心肌細(xì)胞中，F(xiàn)OG2基因的表達(dá)能抑制Gata4依賴性的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。2000年，該研究組運(yùn)用基因定位突變的方法來(lái)探究FOG2基因在正常心臟發(fā)生中的作用。研究顯示FOG2基因缺陷的小鼠在胚胎期的第13天因?yàn)槌溲孕牧λソ叨劳觯憩F(xiàn)為一種三尖瓣閉鎖綜合征，包括三尖瓣的缺失、嚴(yán)重的房間隔缺損、室間隔缺損、左心室流出道的延長(zhǎng)、主動(dòng)脈瓣向右移位和肺動(dòng)脈狹窄。這些FOG2基因缺陷的小鼠在發(fā)育中同時(shí)也存在著左心室發(fā)育不全。該研究展示了FOG2在正常心臟的瓣膜發(fā)育中的重要作用以及提示了三尖瓣閉鎖綜合征的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

2000年，Tevosian等［8］通過(guò)敲除小鼠的FOG2基因來(lái)獲得FOG2-／-小鼠，敲基因小鼠在胚胎形成的中期死亡，表現(xiàn)出嚴(yán)重的心血管畸形，包括共同房室通道、心室肌發(fā)育不良、冠狀動(dòng)脈缺失和法洛四聯(lián)征。另外，在FOG2-／-小鼠的心臟中，冠狀動(dòng)脈發(fā)生非常明顯的缺失。而使FOG2在心肌細(xì)胞中重新表達(dá)能修復(fù)FOG2-／-小鼠的血管表型，進(jìn)一步展示了FOG2基因在心肌中的作用以及在冠狀動(dòng)脈的發(fā)育中至關(guān)重要。

2001年，Crispino等［9］建立了使GATA4蛋白單個(gè)氨基酸被取代的小鼠模型，削弱其與FOG2蛋白的相互作用。這些小鼠在胚胎期的第12天死亡，表型與FOG2-／-小鼠相似，除了GATA4突變小鼠還存在半月瓣的畸形和雙右室流出道。此項(xiàng)研究提示GATA4的功能依賴于FOG2蛋白和另一種心臟特異性FOG蛋白間的相互作用。

3 FO G2基因突變與TOF的關(guān)系

3.1 FOG2基因突變的研究 FOG2基因突變大多是外顯子的錯(cuò)義突變、同義突變、移碼突變，以及5’UTR區(qū)的變異、非編碼的外顯子的變異、內(nèi)含子剪接異常、外顯子無(wú)義突變形成額外的終止密碼子和起始密碼子造成蛋白的截短或延長(zhǎng)等。它的單個(gè)或多個(gè)基因的突變或異常表達(dá)均會(huì)導(dǎo)致心血管發(fā)育異常，影響心臟畸形的發(fā)生。

2003年，Pizzuti等［10］對(duì)47個(gè)TOF患者的FOG2基因進(jìn)行測(cè)序，在其中2個(gè)患者中各發(fā)現(xiàn)了1個(gè)突變（S657 G、E30 G）。2011年，De Luca等［11］在1個(gè)散發(fā)的雙右室流出道的患者中，同樣發(fā)現(xiàn)了FOG2基因上E30 G這一突變。2005年，Ackerman等［12］在30個(gè)死亡的膈肌有缺陷的兒童中，在4號(hào)外顯子上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)突變（R112 X），尸體解剖顯示患者具有肺發(fā)育不良和先天性膈疝。該研究提示FOG2基因這個(gè)突變可能會(huì)引起原發(fā)性的肺部和膈肌缺陷。2007年，Bleyl等［13］在96個(gè)先天性膈疝的患者中發(fā)現(xiàn)了FOG2基因7號(hào)外顯子上的2個(gè)突變（M 703L、T843 A）。2012年，Tan等［6］在1個(gè)雙右室流出道患者中發(fā)現(xiàn)了同樣的突變（M 703L）。2011年，De Luca等［11］在1個(gè)散發(fā)的雙右室流出道的患者中發(fā)現(xiàn)了FOG2基因6號(hào)外顯子的一個(gè)突變（I227 M），另外，在1個(gè)散發(fā)的TOF患者中，在FOG2基因8號(hào)外顯子上發(fā)現(xiàn)了另外一個(gè)突變（M544I）。2012年，Tan等［6］在1個(gè)雙右室流出道合并室間隔缺損的新生兒中發(fā)現(xiàn)了FOG2基因8號(hào)外顯子上的一個(gè)突變（K737E）

到目前為止，國(guó)內(nèi)外主要報(bào)道了13種導(dǎo)致先天性心臟病的FOG2基因突變，其中大多數(shù)都發(fā)生在多個(gè)不相干的家庭。而導(dǎo)致法洛四聯(lián)癥的突變有3種：E30 G、S657 G、M 544I。其中S567 G和M 544I僅見(jiàn)于TOF患者，E30 G除了見(jiàn)于TOF患者外，還可以見(jiàn)于雙右室流出道的患者中。

2012年，我國(guó)趙明等［21］通過(guò)對(duì)106例TOF患者FOG2基因編碼區(qū)的突變或單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，在16例不同患者FOG2基因的2、6、8號(hào)外顯子上，分別發(fā)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)基因的改變，并將新發(fā)現(xiàn)的基因改變位點(diǎn)在110名健康人中進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)其改變位點(diǎn)均為突變位點(diǎn)。V60E、E44 V突變點(diǎn)位于N端轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)構(gòu)域上，V339I突變點(diǎn)位于第3鋅指結(jié)構(gòu)域上，N868S突變位點(diǎn)位于第7鋅指結(jié)構(gòu)域上。另外，在外顯子8上還發(fā)現(xiàn)5個(gè)已知的SNPs：rs11993776、rs16873732、rs16873732、rs35998713、rs1442320。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于FOG2基因與法洛四聯(lián)癥的研究開(kāi)始發(fā)生停滯，原因是雖然確定FOG2基因突變與TOF的發(fā)病具有相關(guān)性，但是其中的機(jī)制卻缺乏一個(gè)能得到普遍認(rèn)同的解釋，加上近年來(lái)的研究也沒(méi)有對(duì)FOG2基因?qū)OF的作用有新的提示與猜測(cè)。另一方面也增加FOG2基因與TOF關(guān)系與作用的可研究性。

3.2 FOG2基因突變導(dǎo)致法洛四聯(lián)癥的可能機(jī)制

隨著人們對(duì)FOG2基因結(jié)構(gòu)以及在心臟發(fā)育中的表達(dá)有了一定的了解，更多的研究方向轉(zhuǎn)向FOG2基因的功能和調(diào)控機(jī)制。

1999年，Pehlivan等［14］通過(guò)FISH分析發(fā)現(xiàn)一些基因型為del（8）（D23.1）的先天性心臟畸形患者，而8p23、l的中段缺失包括FOG2基因。這提示FOG2基因單倍體功能不全可能是一些先天性心臟畸形的病因?qū)W基礎(chǔ)。

2001年，Crispino等［9］運(yùn)用基因定點(diǎn)突變技術(shù)改變GATA4的氨基端和FOG2結(jié)合的氨基酸，表現(xiàn)如基因敲除小鼠。研究發(fā)現(xiàn)在TOF患兒中存在FOG2基因突變，在正常對(duì)照人群中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。推測(cè)FOG2／GATA4轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的變異在TOF患者心臟發(fā)育過(guò)程心前細(xì)胞的異常遷移和行為發(fā)揮作用。了解心臟前體細(xì)胞的行為，可以對(duì)以后不影響心臟血液動(dòng)力學(xué)的外科修復(fù)提供臨床支持。

2003年，Pizzuti等［10］在47例TOF患者中發(fā)現(xiàn)2個(gè)FOG2基因編碼區(qū)的突變（S657、E30 G）。為了檢測(cè)突變是否改變FOG2蛋白的功能，運(yùn)用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GSTPull-dow n試驗(yàn)結(jié)合T NT系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯突變蛋白（Pro mega，Madison，W I），SDS-PAGE檢測(cè)FOG2-GATA4復(fù)合物。研究證明，F(xiàn)OG2突變蛋白并沒(méi)有影響GATA4與FOG2蛋白的結(jié)合。隨后，為了研究突變的FOG2蛋白是否保留影響GATA4轉(zhuǎn)錄活性的能力，利用熒光報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)GATA4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)E30 G突變的FOG2蛋白與野生型的FOG2蛋白對(duì)GATA4的抑制作用并無(wú)明顯差別，而S657 G突變的FOG2蛋白與野生型的FOG2蛋白相比，對(duì)GAT A4的抑制作用則有所降低。研究提示FOG2基因突變，雖然不影響FOG2蛋白與GATA4蛋白的結(jié)合，但卻可能通過(guò)降低FOG2蛋白對(duì)GATA4的抑制作用，影響GATA4的轉(zhuǎn)錄活性，而GATA4基因是一種在早期心臟發(fā)育過(guò)程中起作用的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，GATA4基因敲除小鼠不能形成腹側(cè)心管。通過(guò)這樣的機(jī)制，最終導(dǎo)致TOF和其他心血管畸形的形成。

類似的，2006年，Nemer等［15］在26例TOF患者中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)GATA4第一個(gè)鋅指區(qū)域上的突變（E216D），這個(gè)突變同樣不影響GATA4與FOG2蛋白的結(jié)合，以及GATA4與DNA的結(jié)合，但卻降低了下游目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄活性。

無(wú)論是FOG2基因的突變還是GATA4基因氨基結(jié)合區(qū)域的突變，都不影響兩者的結(jié)合，但卻降低了FOG2基因?qū)ATA4的調(diào)節(jié)作用，可能通過(guò)這樣的機(jī)制，最終影響了心臟的發(fā)生，導(dǎo)致了TOF的形成。當(dāng)然，現(xiàn)在對(duì)于FOG2和GATA4基因的研究還不夠深入，需要更多的研究與實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡述FOG2基因的變異導(dǎo)致TOF發(fā)生的機(jī)制。

4 FOG2基因拷貝數(shù)量變化（CNV）與TOF的關(guān)系

4.1 拷貝數(shù)量變化（CNV）與人類疾病 拷貝數(shù)量變化（copy nu m ber variation，CNV）是由于基因組重排導(dǎo)致的主要結(jié)構(gòu)變異類型，包括亞顯微結(jié)構(gòu)下大于1kb基因片段的缺失和重復(fù)。CNV被認(rèn)為是影響人類疾病的主要遺傳因素之一，突變頻率比單核苷酸多態(tài)性（SNP）高的多。CNV證實(shí)與孟德?tīng)栠z傳疾病、散發(fā)性疾病和復(fù)雜疾病的易感性有關(guān)，通過(guò)改變相關(guān)基因的劑量產(chǎn)生臨床表型［16］。各種機(jī)制參與CNV的形成，主要分為2大類：以DNA重組為基礎(chǔ)和DNA復(fù)制為基礎(chǔ)。

2010年，美國(guó)WTCC（The Wellco me Trust Case Control Consortium）協(xié)會(huì)運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）對(duì)8種常見(jiàn)病的16 000例患者進(jìn)行拷貝數(shù)量變化（CNV）的檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)并證實(shí)克羅恩病、1型糖尿病的患者中存在拷貝數(shù)量變化（CNV）的改變［17］。類似的，先天性心臟病也極有可能與拷貝數(shù)量的變化存在極大的關(guān)系。

4.2 Alu序列介導(dǎo)的外顯子缺失和重復(fù)常常導(dǎo)致疾病的發(fā)生 Alu序列是哺乳動(dòng)物基因組中短分散重復(fù)序列家族（SIN E）的一員，約有50萬(wàn)份拷貝。

也就是說(shuō)平均4～6 kb中就有1個(gè)Alu序列。靈長(zhǎng)類動(dòng)物基因組中的許多Alu序列為不等同源重組事件提供了大量的機(jī)會(huì)，Alu序列也就成為了重組的熱點(diǎn)。這些重組事件如果發(fā)生在染色體內(nèi)，導(dǎo)致1個(gè)基因中外顯子的刪除或復(fù)制，當(dāng)它們發(fā)生在染色體間時(shí)，會(huì)引起更復(fù)雜的染色體異常如易位或重排?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類許多疾病由Alu重復(fù)序列之間的不等同源重組引起的，如R B1基因缺失引起的神經(jīng)膠質(zhì)腦瘤、Dystrophin基因重復(fù)引起的Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良。Alu介導(dǎo)的突變大概占了人類遺傳病的0.3%［18］。

4.3 TOF患者中存在FOG2基因拷貝數(shù)量變化（CNV）的猜測(cè) 1991年，Gelb等［19］發(fā)現(xiàn)大約38%的8號(hào)染色體重組綜合征患者患有TOF，其中1個(gè)染色體斷裂點(diǎn)位于8q22，F(xiàn)OG2基因所在區(qū)域。2005年，Ackerman等［12］在1位先天性膈疝和肺發(fā)育不良的患者中發(fā)現(xiàn)一個(gè)無(wú)義突變（R112 X），突變位于鋅指結(jié)構(gòu)功能區(qū)前，由于生物體內(nèi)存在無(wú)義突變導(dǎo)致的m RNA降解，該突變相當(dāng)于缺失一份等位基因。雖然從國(guó)內(nèi)外的報(bào)道中，TOF患者中FOG2基因的拷貝數(shù)量變化（CNV）都還沒(méi)有陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，但從人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)FOG2基因也富含Alu序列，據(jù)此，推測(cè)FOG2基因的CNV在TOF患者中是存在的，但是占的比例為多少，需要進(jìn)一步研究。

4.4 TOF患者中拷貝數(shù)量變化（CNV）的檢測(cè)方法

目前，主要作為檢測(cè)點(diǎn)突變而開(kāi)展的方法，如測(cè)序和變性高效液相色譜法，一般不能檢測(cè)拷貝數(shù)的變化。目前發(fā)展了很多檢測(cè)CNV的方法，Southern blot分析將揭示許多畸變，但不能發(fā)現(xiàn)小缺失，并且不是理想的常規(guī)技術(shù)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR，可以檢測(cè)特點(diǎn)良好的缺失和擴(kuò)增，但由于1個(gè)反應(yīng)只能針對(duì)1個(gè)位點(diǎn)，要準(zhǔn)確地定位缺失位點(diǎn)還很麻煩；熒光原位雜交技術(shù)（FISH）使用特異性探針同細(xì)胞中期分裂相的染色體（或DNA纖維）雜交，能顯著提高結(jié)構(gòu)變異的清晰度，但由于工作量巨大，且不能檢測(cè)到較小缺失重復(fù)片段的單一基因畸變；比較基因組雜交技術(shù)（CGH）適用于整個(gè)基因組的研究篩選，但成本高，技術(shù)復(fù)雜；多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）是最早由荷蘭學(xué)者Dr.Schouten JP［20］于2002年提出，是一種高通量、針對(duì)待測(cè)核酸中靶序列進(jìn)行定性和定量分析的新技術(shù)，它利用簡(jiǎn)單的雜交（hybridization）、連接（ligation）及PCR擴(kuò)增（PCR am plification）反應(yīng)，于單一反應(yīng)管內(nèi)可同時(shí)檢測(cè)40個(gè)不同的核苷酸序列的拷貝數(shù)變化。MLPA在檢測(cè)CNV變化尤其是基因內(nèi)的缺失和重復(fù)具有很大的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)從DNA提取、反應(yīng)至結(jié)果分析僅需2天。此外，因?yàn)樗褂玫姆磻?yīng)條件都相同，所以在相同的操作條件下MLPA技術(shù)有不同的應(yīng)用，可以平行處理不同的檢測(cè)項(xiàng)目。

5 檢測(cè)FOG2基因變異的臨床意義

2011年，Tan等［6］通過(guò)對(duì)FOG2基因與TOF發(fā)生的特異性和敏感度分析顯示，雖然其靈敏度不高，但有較高的特異性，據(jù)此可以為FOG2基因在TOF的產(chǎn)前診斷和基因治療提供依據(jù)。

FOG2基因是心臟發(fā)育過(guò)程中較早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，與GATA4相互作用貫穿心臟發(fā)育的全過(guò)程，在心臟的發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。該基因發(fā)生變異將可能導(dǎo)致先天性膈疝、法洛四聯(lián)癥（TOF）或雙右室流出道（DORV），對(duì)于妊娠期的婦女，特別是帶有明顯家族史的婦女，通過(guò)抽取產(chǎn)前絨毛組織或羊水，進(jìn)行FOG2基因篩查，結(jié)合胎兒超聲心動(dòng)圖的檢查，提早發(fā)現(xiàn)心臟發(fā)育異常的胎兒，爭(zhēng)取早期治療和終止妊娠的機(jī)會(huì)，減輕家庭負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。

6 結(jié) 語(yǔ)

迄今為止，國(guó)內(nèi)外研究對(duì)FOG2基因的結(jié)構(gòu)、功能和在心臟發(fā)育中的表達(dá)已經(jīng)有了一定的了解，也發(fā)現(xiàn)了多種FOG2基因的變異。但FOG2基因?qū)е峦蛔兊臋C(jī)制仍未得到普遍的認(rèn)可。預(yù)測(cè)FOG2基因中存在拷貝數(shù)量變化（CNV）至今也還沒(méi)有陽(yáng)性報(bào)道。而且國(guó)內(nèi)對(duì)FOG2基因的研究由于研究樣品小，所發(fā)現(xiàn)的突變是否為我國(guó)TOF的功能性致病位點(diǎn)，還需要進(jìn)一步的研究與證實(shí)。

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編輯：宋文穎

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2013-07-12）