徐 陽，唐艷萍

潰瘍性結(jié)腸炎的病因至今未明，可能與感染、免疫、遺傳、環(huán)境等多種因素相關(guān)。患者病情常常遷延不愈，且極容易復(fù)發(fā)，因此對潰瘍性結(jié)腸炎的深入研究非常重要。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制、疾病發(fā)展規(guī)律以及相關(guān)治療藥物的研究與開發(fā)，都以動物模型為基礎(chǔ)，選擇建立操作簡單、臨床相似度高、穩(wěn)定的動物模型對后續(xù)的實驗研究至關(guān)重要。潰瘍性結(jié)腸炎的實驗動物模型建立方法有很多種，大致可分為免疫法、化學(xué)法、復(fù)合法、基因模型以及中醫(yī)模型五大種類。這些動物模型的建立方法各有優(yōu)劣，本文對潰瘍性結(jié)腸炎動物模型逐一介紹，并對其優(yōu)缺點進行評價，除此之外還介紹我們自己的動物模型經(jīng)驗及改良方法。

1 免疫法

免疫法建立潰瘍性結(jié)腸炎模型的原理都是利用同種或異種的異體組織致敏，但在造模方法上，抗原來源和模型處理各不相同，具體方法主要包括：結(jié)腸黏膜組織致敏模型、胎鼠結(jié)腸種植模型、大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株模型。免疫法建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，癥狀相對較輕，且多為慢性炎癥，故而所需要的實驗周期較長，但與人潰瘍性結(jié)腸炎的臨床癥狀比較相似，對于抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的新藥篩選，有一定意義[1]。

1.1 結(jié)腸黏膜組織致敏模型 可選用同種異體或異種異體，即利用其他大鼠或者其他動物的結(jié)腸黏膜組織所制成的勻漿，冷凍24 h，融凍后3000 r/min 離心30 min，提取上清液提純，并測定蛋白含量，使用上清液前應(yīng)加入Frend 佐劑，分別于第1 d、第10 d，在大鼠足墊內(nèi)注射上清液0.1～0.3 mL，第17 d，大鼠背部注射上清液0.1～0.3 mL，第24 d，大鼠腹股溝處注射上清液0.1～0.3 mL，第30 d腹腔注射注射上清液0.1～0.3 mL（此時上清液中不加佐劑），腹腔注射5 d后，大鼠可產(chǎn)生類似臨床潰瘍性結(jié)腸炎癥狀[2]。

本方法的優(yōu)點在于穩(wěn)定性好、臨床相似度高，但實驗周期過長，需要一定實驗設(shè)備和實驗技術(shù)支持。

1.2 胎鼠結(jié)腸種植模型 受孕14～16 d的孕鼠，處死后取胎鼠結(jié)腸3～4 cm，以胎鼠結(jié)腸為抗原，無菌手術(shù)移植至同系的成年鼠腎包膜下，術(shù)后正常飼養(yǎng)7 d，可產(chǎn)生典型的細(xì)胞免疫反應(yīng)，也就是宿主的抗移植反應(yīng)，解剖結(jié)腸可見炎性反應(yīng)，20 d后可見典型潰瘍性結(jié)腸炎形成[3]。

本方法可以模擬臨床上潰瘍性結(jié)腸炎的慢性炎癥反應(yīng)病程[4]，在模型建立過程中，自身抗體所起到的重要作用，可以幫助分析潰瘍性結(jié)腸炎病因中免疫因素所起到的作用。但是該模型需要嚴(yán)格的無菌操作，技術(shù)難度高，成功率低，造模周期長。

1.3 大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株模型 大腸桿菌為正常腸道菌群，將其作為抗原，誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)?？扇〗】荡笫蠼Y(jié)腸內(nèi)容物，37℃24 h細(xì)菌培養(yǎng)。取典型細(xì)菌擴增，鑒定確定為大腸桿菌后，利用福爾馬林殺死細(xì)菌，并用生理鹽水沖洗2～3次，制備混懸液。首次大鼠足墊內(nèi)注射混懸液0.2 mL，第10 d腹部皮下注射0.4 mL，第17 d背部皮下注射0.6 mL，第24 d腹腔注射1.2 mL。三周后大鼠可出現(xiàn)黏液便、血便、病理組織學(xué)改變等，類似臨床潰瘍性結(jié)腸炎的變化，并逐漸加重，一月后即可出現(xiàn)典型潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，同時還有循環(huán)免疫復(fù)合物的增加以及細(xì)胞免疫功能低下等現(xiàn)象的發(fā)生[5]。

本方法抗原較易獲得、實驗成本低，同時也佐證發(fā)病機制假說中腸道正常菌群失調(diào)誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎的肯能性，是較好的病因?qū)W研究模型。但本實驗的實驗周期較長，并且需要實驗器材制備大腸桿菌混懸液。

2 化學(xué)刺激法

化學(xué)刺激法因其實驗成本低、操作簡單、成功率高且在短期內(nèi)可出現(xiàn)明顯癥狀，故在潰瘍性結(jié)腸炎的動物研究中屬于應(yīng)用較為廣泛的模型，但以化學(xué)藥物刺激動物結(jié)腸黏膜，造成動物結(jié)腸黏膜及血管損傷，與臨床上潰瘍性結(jié)腸炎的病因具有較大的差異，且模型自愈性極強，故而對實驗研究具有局限性，不適合用于抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物的療效觀察，但對結(jié)腸炎癥病變的愈合等機制研究仍具有一定意義。

2.1 聚糖硫酸鈉模型 對大鼠灌服由蔗糖合成的一種硫酸多糖體-聚糖硫酸鈉，可以誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎。聚糖硫酸鈉可以導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，腸道黏膜屏障破壞以及巨噬細(xì)胞功能紊亂[6]，并且對大鼠的結(jié)腸上皮產(chǎn)生毒性作用，可以建立類似臨床潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠慢性結(jié)腸炎癥模型。大鼠灌服3%聚糖硫酸鈉溶液連續(xù)10 d，大鼠結(jié)腸黏膜可出現(xiàn)充血、水腫、糜爛及潰瘍，與人類潰瘍性結(jié)腸炎相似。大鼠長期飲用1.5%的聚糖硫酸鈉溶液，可造成持續(xù)6周以上的慢性潰瘍性結(jié)腸炎。

聚糖硫酸鈉模型模擬潰瘍性結(jié)腸炎造模方法簡單，且聚糖硫酸鈉灌服大鼠所誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型，還可發(fā)生不典型增生和結(jié)腸腺癌，故而在探討潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中腸道菌群失調(diào)、巨噬細(xì)胞功能紊亂以及結(jié)腸炎正相關(guān)不典型增生和癌癥發(fā)生機制的研究具有極為重要的意義。

2.2 角叉菜膠模型 角叉萊膠是一種硫酸多糖，多于紅海藻中提取，能夠?qū)Y(jié)腸細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜通透性增強。配置3%角叉菜膠溶液灌飲豚鼠，一周后動物開始出現(xiàn)體重減輕、腹瀉、黏液膿血便，14 d 后解剖豚鼠結(jié)腸，可見潰瘍和出血灶；病理觀察結(jié)腸黏膜及黏膜下層炎性細(xì)胞包浸潤，類似臨床潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)[7]。

該模型病變僅局限于結(jié)腸和直腸，在停止灌飲角叉菜膠后，結(jié)直腸炎癥仍可持續(xù)10～14 d，能相對較好模擬慢性病程，但該模型一般所選用的豚鼠造價較高。

2.3 惡唑酮模型 惡唑酮是一種經(jīng)典的半抗原物質(zhì)[8]，是染料、農(nóng)藥等的重要中間體。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，惡唑酮對大鼠灌腸，可以誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型生成。在此模型中，細(xì)胞因子可過量分泌白細(xì)胞介素4，故而屬于Th2 亞型炎癥反應(yīng)。將小鼠麻醉后，用惡唑酮溶液對小鼠灌腸，小鼠5 d后即可出現(xiàn)腸道炎癥[9]，結(jié)腸肉眼可見黏膜充血水腫，糜爛潰瘍，鏡下見結(jié)腸黏膜潰瘍，偽膜形成，腺管廣泛消失，黏膜下組織出血，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤。7 d左右病情好轉(zhuǎn)，10 d左右基本痊愈。

利用惡唑酮建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，速度較快，重復(fù)性好且制作簡單，但是疾病維持時間相對較短，小鼠模型有自愈傾向，缺少慢性過程，對于慢性復(fù)發(fā)性潰瘍性結(jié)腸炎的模擬度不高。

3 復(fù)合法

復(fù)合法模型的致病機制是首先破壞結(jié)腸黏膜屏障，再利用半抗原物質(zhì)與腸組織蛋白結(jié)合，形成完全抗原，導(dǎo)致腸黏膜發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，從而造成結(jié)腸黏膜的損傷。復(fù)合法模型綜合體現(xiàn)了潰瘍性結(jié)腸炎的兩個最可能的致病原因：結(jié)腸黏膜屏障的損害與免疫調(diào)節(jié)失衡，是目前較為公認(rèn)的潰瘍性結(jié)腸炎經(jīng)典造模方法。

3.1 二硝基氯苯-乙酸復(fù)合模型 乙酸破壞結(jié)腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)，進而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，二硝基氯苯作為半抗原與結(jié)腸組織蛋白結(jié)合，能夠誘發(fā)T 細(xì)胞依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，利用二硝基氯苯-乙酸溶液灌腸，可誘發(fā)大鼠的變態(tài)反應(yīng)，從而建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型[10]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，一周后用直徑3 mm 的硅膠管經(jīng)肛門插入結(jié)腸8 cm 處，注入0.04 mmol/L二硝基氯苯溶液0.25 mL，兩周后，同部位注射乙酸溶液2 mL，建模完成。模型建立1～2 周，動物即可出現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎的典型表現(xiàn)，并可持續(xù)到十六周以上。

此模型動物存活率高，操作簡單，其臨床及病理表現(xiàn)與人潰瘍性結(jié)腸炎極為相似。此模型與三硝基苯磺酸-乙醇模型的造模機制相類似，但是造模藥物劑量與三硝基苯磺酸-乙醇模型相比，較難控制，故而臨床采用較少。

3.2 三硝基苯磺酸-乙醇復(fù)合模型 利用以乙醇為溶劑的三硝基苯磺酸溶液對大鼠灌腸，乙醇首先破壞大鼠結(jié)腸黏膜屏障，而三硝基苯磺酸作為一種半抗原，可與大鼠體內(nèi)蛋白結(jié)合，形成抗原，從而產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)，繼而誘發(fā)結(jié)腸炎癥。將硅膠管緩慢插入大鼠結(jié)腸8 cm 處，注入三硝基苯磺酸-乙醇溶液0.5 mL/只，模型可在一周內(nèi)可建立成功，三周后形成慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型，并可持續(xù)約7～8周時間。

三硝基苯磺酸與乙醇灌腸一次致炎是目前最為常用的潰瘍性結(jié)腸炎模型建立方法，具有其他建模方法所沒有的優(yōu)點[11]。該模型所選用的三硝基苯磺酸-乙醇溶液造價較低，模型建立方法簡單，模型持續(xù)時間較長，可充分體現(xiàn)急性炎癥向慢性轉(zhuǎn)化這一病情遷延過程，并且其與臨床上的潰瘍性結(jié)腸炎模型具有極高的相似度。

筆者對該經(jīng)典方法進行了如下改良[12]：⑴利用灌胃針代替?zhèn)鹘y(tǒng)灌腸硅膠管，解決了灌腸液的溢出問題，增加了后續(xù)實驗的可信度；⑵利用麻醉機替代傳統(tǒng)麻醉方法，減少了外界刺激，增加的造模的穩(wěn)定性，提高了造模效率；⑶確定三硝基苯磺酸溶液150 mg/kg 的380 g/L 乙醇溶液為灌腸最佳劑量，并對三硝基苯磺酸-乙醇復(fù)合模型進行了其他相關(guān)技術(shù)改良和劑量探索。經(jīng)過對模型的改良，使得該模型的造模效率、造模的成功率和模型的穩(wěn)定性有了顯著的提高。

4 基因模型

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)有了長足的發(fā)展，這也為潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立提供了新的思路，逐漸有學(xué)者開始建立基因型潰瘍性結(jié)腸炎動物模型。基因型動物模型對于模擬潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制方面具有極強的針對性，故而對于病因研究、新藥研發(fā)等具有極為重要的意義。目前主要的基因型潰瘍性結(jié)腸炎動物模型包括基因敲除模型和轉(zhuǎn)基因模型。

4.1 基因敲除模型 基因丟失技術(shù)可以通過遺傳學(xué)改變引起實驗小鼠產(chǎn)生類似人類潰瘍性結(jié)腸炎的病理變化。研究所選定的基因，多與免疫致病因素相關(guān)。目前比較成熟的基因缺陷模型所選定的基因有IL-2、IL-10、TCR基因等。IL-2作為一種細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用[13]，它的主要作用包括：⑴激活T細(xì)胞，引起T細(xì)胞的增殖分裂；⑵刺激NK細(xì)胞的生長，增強其殺傷能力；⑶促進B淋巴細(xì)胞分化及抗體產(chǎn)生。小鼠IL-2 基因敲除模型可在小鼠4～9 周齡時發(fā)生巨脾、自身免疫性溶血等并發(fā)癥；6～15周齡時建立成功，模型小鼠病變主要發(fā)生在遠端結(jié)腸，有明顯潰瘍形成和腸壁增厚；18周齡后小鼠有明顯腹瀉和便血；28周齡后小鼠逐漸死于潰瘍性結(jié)腸炎。IL-2 敲除建立潰瘍性結(jié)腸炎動物模型的方法已被大多數(shù)研究者所接受和采用。而IL-10 等基因敲除模型的建立，對其做了很好的補充。

利用基因敲除技術(shù)復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎動物模型，具有自發(fā)性的特點，能很好的模擬人類潰瘍性結(jié)腸炎，對于揭示病因、闡明疾病的遺傳發(fā)病機制，確定易感基因，具有重要意義。但基因敲除模型的建立對于實驗技術(shù)的要求較高，對于實驗有一定的限制性。

4.2 轉(zhuǎn)基因模型 轉(zhuǎn)基因模型可通過同源重組引起的轉(zhuǎn)基因過度表達可以引起小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生。根據(jù)目前的研究，IL-7轉(zhuǎn)基因模型是目前較為成熟的潰瘍性結(jié)腸炎模型，此外還有STAT-4 轉(zhuǎn)基因模型、HLA-B27 轉(zhuǎn)基因模型等。IL-7可影響胸腺T細(xì)胞分化增殖，對于黏膜淋巴細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用。IL-7 過度表達可以使黏膜淋巴細(xì)胞大量激活而導(dǎo)致炎癥，然后IL-7 缺乏，淋巴細(xì)胞大量凋亡，潰瘍性結(jié)腸炎進入慢性期[14]。

轉(zhuǎn)基因模型與人類潰瘍性結(jié)腸炎相似度高，為疾病的研究提供了良好的工具和載體，但是轉(zhuǎn)基因模型的建立同樣具有相當(dāng)?shù)募夹g(shù)難度。同時潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病具有復(fù)雜性，遺傳學(xué)研究提示其可能為多基因疾病，并沒有單一的基因和潰瘍性結(jié)腸炎獨立相關(guān)，故而轉(zhuǎn)基因模型同樣不能做到完全模擬人類潰瘍性結(jié)腸炎和闡明其全部發(fā)病機制。

5 中醫(yī)模型

中醫(yī)對于潰瘍性結(jié)腸炎的辯證分型共六型：⑴大腸濕熱證；⑵脾虛濕蘊證；⑶寒熱錯雜證；⑷脾腎陽虛證；⑸陰血虧虛證；⑹肝郁脾虛證。根據(jù)中醫(yī)證型所模擬出的肝郁脾虛型、脾虛型以及濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎動物模型，在中醫(yī)病因病機、中醫(yī)辨證論治研究方面，具有其獨特價值。

5.1 肝郁脾虛型模型 每天一定時間利用夾尾急性激怒、捆綁等情志刺激使大鼠之間相互撕咬、打斗，以此來改變大鼠的生理狀態(tài)。處理1 次/d，每次操作時間為30 min。隔日禁食，禁食時將飼料放置在大鼠可以看到卻無法觸摸的地方。大鼠情緒經(jīng)歷穩(wěn)定、易怒、倦怠的變化過程，至造模第15日，大鼠可出現(xiàn)反應(yīng)遲緩、倦怠少動、毛發(fā)枯亂、食少便溏、體重減輕等現(xiàn)象，則模擬郁怒日久、木郁乘土、肝郁脾虛的病理過程成功，制造大鼠肝郁脾虛證模型[15]，三周后利用醋酸灌注大鼠結(jié)腸，模擬潰瘍性結(jié)腸炎模型，從而建立大鼠肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型[16-17]。

該模型是目前較為理想的肝郁脾虛模型潰瘍性結(jié)腸炎模型，但是由于中醫(yī)癥候本身極為復(fù)雜，現(xiàn)階段缺乏系統(tǒng)合理的中醫(yī)評價體系、缺乏靈敏性、特異性指標(biāo)，相對于單純西醫(yī)方法所建立的潰瘍性結(jié)腸炎模型，尚有研究改進的余地。

5.2 脾虛型模型 中藥番瀉葉苦寒瀉下，用其灌服大鼠，可使大鼠產(chǎn)生消瘦、畏寒、懶動、精神不振等脾虛的癥狀[18]。灌服過程中大鼠需禁食12 h，無需禁水。1 次/d 灌服潘瀉葉浸劑，3 d 后，禁食不禁水35 h，應(yīng)用化學(xué)刺激法中的冰乙酸對大鼠灌腸，復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎的病理變化，次日繼續(xù)每日灌服潘瀉葉2 d，至第8 d禁食不禁水，第12 d即可成功建立大鼠脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型[19-20]。

脾虛是潰瘍性結(jié)腸炎的基本病因之一，但潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制與多因素先關(guān)，如血瘀、濕熱、陽虛等，脾虛型模型，從另一個角度闡述了潰瘍性結(jié)腸炎的病因，與肝郁脾虛模型互為補充。

5.3 濕熱型模型 采用高脂高糖飲食造成濕熱體質(zhì)后，利用三硝基苯磺酸-乙醇復(fù)合法灌腸，可以構(gòu)建出較為理想的濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎模型[21]。具體方法為：在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，自由飲用濃度為200 g/L的蜂蜜水，每日上午灌服豬油10 g/kg，30 min 后灌服56°白酒10 mL/kg 白酒，共持續(xù)10 d，以造成內(nèi)因濕熱模型。在造模的第11 d 禁食24 h，腹腔注射麻醉后予三硝基苯磺酸100 mg/kg和50%乙醇0.25 mL混合液體灌腸，可復(fù)制成功濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。大鼠在濕熱造模期間可出現(xiàn)醉酒表現(xiàn)、少食、體重下降及特征性黏液便。病理學(xué)可見明顯充血水腫、發(fā)潰瘍、炎細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象[22]。

脾胃虛弱是濕熱發(fā)病的前提條件，以飲食不節(jié)，饑飽失常，過食肥甘的方法損傷脾胃，阻礙運化，可成功制造內(nèi)濕，是經(jīng)典的內(nèi)因制造濕熱證方法。采用高脂高糖飲食聯(lián)合三硝基苯磺酸-乙醇復(fù)合法灌腸，成功制造潰瘍性結(jié)腸炎濕熱型模型，填補了中醫(yī)潰瘍性結(jié)腸炎模型分型的空白。

近年來，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率有逐漸升高的趨勢[23]，并且疾病本身的發(fā)病機制并不十分明確，使得潰瘍性結(jié)腸炎在治療手段上一直停滯不前。故而在臨床前研究中，選擇一種穩(wěn)定性強、重復(fù)性好，操作簡單并且與臨床癥狀相似度高的動物模型十分重要，這也是研究潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制、研發(fā)臨床新型藥物的基礎(chǔ)?，F(xiàn)階段潰瘍性結(jié)腸炎動物模型的建立方法雖然有很多，但是也存在不少的缺陷，比如很難模擬潰瘍性結(jié)腸炎的復(fù)發(fā)交替過程等。隨著對于潰瘍性結(jié)腸炎的研究不斷深入，一些新型造模方法陸續(xù)出現(xiàn)，如：基因敲除、轉(zhuǎn)基因等[24]。新型造模方法具有其臨床相似度高等優(yōu)勢，但也存在技術(shù)難度大、實驗成本高等缺點，但是正是因為不斷涌現(xiàn)的新型技術(shù)，為人類研究潰瘍性結(jié)腸炎，提供了希望和廣闊的前景。

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