曹曉玉，楊佳玫，楊虹琦* ，王玉平，尹麗莉

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128;2貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，貴陽(yáng)550009)

早在1887年，Wallach根據(jù)萜類化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)提出了異戊二烯規(guī)律，并給出了不同萜類化合物的定義。萜類化合物是異戊二烯(C10H16)的聚合體及其含氧的飽和程度不等的一類衍生物的統(tǒng)稱。從結(jié)構(gòu)上劃分成若干個(gè)異戊二烯單位，而稱為異戊二烯規(guī)律。其實(shí)生物體內(nèi)萜類并非由異戊二烯相互聚合形成的，植物體內(nèi)萜類形成的前體是乙烯生成的甲戊二羥酸，稱為生源的異戊二烯規(guī)則［1，2］。按其在植物體內(nèi)的生理功能，植物中萜類化合物可分為初生代謝物和次生代謝物兩大類。萜類化合物作為初生代謝物的數(shù)量少，卻極為重要，包括甾體、胡蘿卜素、植物激素、多聚萜醇、醌類等。此類化合物中的一部分是細(xì)胞膜組成成分和膜上電子傳遞的載體，還有一部分是對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理功能起作用的成分。萜類化合物的主要功能包括:膜上電子傳遞的載體，如醌類;參與光合作用，如胡蘿卜素類和葉綠素的側(cè)鏈;植物激素，如赤霉素、脫落酸。也有人把萜類化合物看作是植物的植保素，雖然不是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的物質(zhì)，但在調(diào)節(jié)植物與環(huán)境之間的關(guān)系上發(fā)揮著重要的生態(tài)作用，是植物中不可或缺的組成成分。

萜類化合物根據(jù)組成的異戊二烯單位的數(shù)量不同可分為半萜、單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、三倍半萜和四萜等。含有一個(gè)異戊二烯單位的萜類稱為半萜，含有兩個(gè)異戊二烯單位的萜類稱為單萜，據(jù)此類推，劃分萜類化合物。這些萜類都有開鏈和成環(huán)之分。根據(jù)分子中的碳環(huán)數(shù)目，也可將萜烯類化合物分為鏈萜(無環(huán)萜)、單環(huán)萜、雙環(huán)萜、三環(huán)萜等。而萜類大多數(shù)是含氧衍生物，據(jù)此又可分為萜醇、萜醛、萜酮、萜羧酸和萜酯等［1］。

分子中含有雙鍵的萜類化合物又可稱為萜烯類化合物。萜烯類化合物迄今為止已發(fā)現(xiàn)了近3萬(wàn)種。萜類化合物是植物和動(dòng)物體內(nèi)大量存在的天然有機(jī)化合物，其中有半數(shù)以上是在植物中發(fā)現(xiàn)。如從植物中提取的香精油、薄荷油、松節(jié)油等，植物及動(dòng)物體中的某些色素，胡蘿卜素、蝦紅素等等。

1 植物萜類化合物的種類

萜類化合物的種類繁多，數(shù)量龐大，在植物中的分布極為廣泛。藻類、菌類、苔蘚類、地衣類、蕨類、裸子植物及被子植物中均存在萜烯類化合物，其中種子植物特別是被子植物含量最為豐富。在種子植物中分布廣泛，普遍存在于松科、柏科、楝科、唇形科、傘形科、菊科、衛(wèi)矛科、樟科、蓼科等20多個(gè)科中。種類繁多，大致統(tǒng)計(jì)有1萬(wàn)種以上，是植物次生代謝產(chǎn)物中最多的一類化合物。萜類化合物經(jīng)常和樹膠、樹脂等并生，富含生物堿的植物通常不含萜類化合物或含量較少，而水生植物中暫未發(fā)現(xiàn)單萜或倍半萜類化合物。其中，單萜在唇形科、傘形科、樟科及松科等植物的腺體、油室及樹脂道內(nèi)廣泛存在。倍半萜集中分布在木蘭科、蕓香科、菊科等植物中。二萜于五加科、馬兜鈴科、菊科、橄欖科、杜鵑科、大戟科、豆科、唇形科及茜草科等植物中主要分布，是形成樹脂的主要物質(zhì)。二倍半萜數(shù)量較少，于羊齒植物、菌類、地衣類中主要分布。三萜是構(gòu)成植物皂苷、樹脂等的重要部分。四萜主要為一些脂溶性色素，廣泛分布于植物中。

植物中“低萜類化合物”也被稱為“揮發(fā)油”，多具揮發(fā)性，常以揮發(fā)油的形式存在于高等植物中。芬蘭研究者Von等從杜香屬植物(L.palustre)中分離鑒定出了幾種脂肪族單萜的結(jié)構(gòu)［3，4］;Lawrence等從杜香屬植物揮發(fā)油中第一次分離提取得到萜類化合物反－3－己烯醇等［5］;Milkhaliova等從杜香屬植物中分離出香葉烯、喇叭茶醇、倍半萜類化合物青蒿素(C15H22O)［6］;Yu 等［7］將梔子果實(shí)以 60% 的乙醇提取，然后浸膏，經(jīng)過D101大孔吸附樹脂柱分離，接著用硅膠柱分離，再采用ODS柱、凝膠柱和凝膠樹脂系列Toyopearl－40 HW凝膠柱產(chǎn)品反復(fù)分離，最后利用制備型高效液相分離，得到單萜類化合物;Chen等采用類似的方法分離得到裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分化合物［8～10］。

環(huán)烯醚萜是一類雙環(huán)單萜，在現(xiàn)今研究資料中研究比較多。環(huán)烯醚萜類化合物在雙子葉植物中廣泛分布，為許多植物藥類的有效成分，如地黃、玄參、梔子、龍膽、車前草、山茱萸、馬錢子、忍冬、肉蓯蓉、雞屎藤和胡黃連中均含該類化合物［11］。該類化合物具有抵抗糖尿病、保肝、利膽和促消化等作用。

二萜類化合物中鏈狀二萜多以植物醇的形式存在，多分布于葉綠素中。在植物雷公藤、紫杉、甜菊葉和黃芩屬植物中都有環(huán)狀二萜成分的存在。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前在黃芩屬植物中分離得到的二萜化合物大部分為新克羅烷雙環(huán)二萜。

三萜類化合物在單子葉和雙子葉植物中均有存在，尤以豆科、石竹科、五加科、桔?？啤⑦h(yuǎn)志科、玄參科等科的植物中分布最為普遍，含量也較高。從小花五味子(S.micrantha)藤莖中分離得到的高度氧化重排的降三萜化合物也顯示出較強(qiáng)的抗HIV－l活性，EC50為 7.71 μg/mL(SI＞ 29.54)［12］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，三萜類化合物具有抗HIV病毒和抗癌等作用。

四萜類衍生物中一類重要物質(zhì)就是多烯色素(polyene pigments)，又稱類胡蘿卜素(carotenoid)，其在植物中分布很廣，如植物葉片中的葉黃素(xanthophyll)、辣椒果實(shí)中的辣椒紅素(capsorubin)。而且類胡蘿卜素在煙草中也有集中分布。由于四萜類化合物分子中有很長(zhǎng)的共軛結(jié)構(gòu)，因此大都有漂亮的顏色，但對(duì)光、熱、氧、酸不穩(wěn)定，所以容易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。四萜類化合物在植物體內(nèi)具重要生理功能，部分是對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理功能起重要作用的成分，有些在調(diào)節(jié)植物與環(huán)境之間的關(guān)系上發(fā)揮重要的生態(tài)功能。

2 煙草中的萜烯類化合物

煙草中富含萜烯類化合物，且種類繁多。如類胡蘿卜素、葉綠素、赤霉素、脫落酸、甾醇等三萜、四萜化合物，它們一般被劃為初生代謝產(chǎn)物，是煙草生長(zhǎng)發(fā)育所不可缺少的;而單萜、倍半萜、雙萜則屬于次生代謝產(chǎn)物，是煙草葉面揮發(fā)物和腺體分泌物的主要組成部分，與煙葉的抗性和香氣品質(zhì)密切相關(guān)［13］。因此，調(diào)控類萜代謝途徑，對(duì)于提高煙草自身對(duì)病害的免疫能力，以及改善煙葉香氣品質(zhì)至關(guān)重要。

萜烯類化合物按煙草香味前體物劃分為3類:類胡蘿卜素、西柏烷類和賴百當(dāng)類。賴百當(dāng)類化合物是香料煙葉中獨(dú)有的香氣成分。Loughrin等通過煙葉組織和花組織的頂空分析發(fā)現(xiàn)，有多達(dá)40種揮發(fā)性萜烯、芳香和脂肪族化合物均來自于煙花中［14，15］。

類胡蘿卜素是煙草中最重要的萜烯類化合物之一，也是煙葉中重要的香氣前體物。類胡蘿卜素的降解產(chǎn)物在所有的煙葉中都發(fā)現(xiàn)，包括紫羅蘭酮、大馬酮和異佛爾酮等，種類已近100種。其中，紫羅蘭酮和大馬酮可增加煙草的花香香味，而異佛爾酮目前是國(guó)內(nèi)外廣泛使用的煙用香料的原料。

類胡蘿卜素在成熟過程中的變化總趨勢(shì)是逐步減少，而在調(diào)制過程中則降解加速。1974年，Whitefield等通過觀察，發(fā)現(xiàn)所有色素均隨成熟過程的推進(jìn)下降;1979年，Gopalam等通過對(duì)印度烤煙成熟期的分析，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜素含量逐步下降。在煙葉醇化過程中，類胡蘿卜素不僅持續(xù)降解使中性香味物質(zhì)總量增加，而且降解產(chǎn)物能發(fā)生轉(zhuǎn)化，生成對(duì)于香味方面更有用的化合物。因此，煙葉經(jīng)過調(diào)制、醇化后，絕大部分類胡蘿卜素都分解消失。羅勃茨等研究指出，煙葉香味與類胡蘿卜素的存在成反比;如果類胡蘿卜素在調(diào)制、醇化過程中不分解，則煙葉的香味不足［15］。色素類物質(zhì)氧化降解是由于雙鍵斷裂，而雙鍵斷裂的部位不同，產(chǎn)生的碳原子數(shù)的化合物不同，從而進(jìn)一步形成許多重要的香氣物質(zhì)。不同類型煙葉和不同的調(diào)制方法，其降解產(chǎn)物也相應(yīng)不同。

西柏烷類(黑松烷類)化合物及其降解產(chǎn)物也是構(gòu)成煙草香味的重要組分。在酶解或加熱等條件下，西柏三烯－4，6－二醇降解，在鍵的斷裂過程中，得到茄尼酮。茄尼酮是煙草中的重要香氣成分，它進(jìn)一步反應(yīng)的產(chǎn)物大多也具香味。在酸的催化下，茄尼酮端基烯鍵和水作用形成醇。經(jīng)過過氧酸的作用，形成環(huán)氧化合物，但該中間產(chǎn)物不穩(wěn)定，其酮基與環(huán)氧基相互作用形成氧雜的雙環(huán)化合物。該化合物具有的特別香味，對(duì)改變煙草香味物質(zhì)起到積極的作用。而茄尼酮經(jīng)一系列環(huán)化氧化反應(yīng)同時(shí)可形成煙草中有名的香味物質(zhì)α－異丙基丁酸內(nèi)酯。煙葉調(diào)制前后，西柏烷類物質(zhì)含量有明顯差異。調(diào)制和醇化后，西柏烷類化合物含量顯著降低，其降解轉(zhuǎn)化成為其他產(chǎn)物，如西柏三烯的a+c，a+e，b+e，c+e位斷裂分別得到 C18、C15、C14、C13 的降西柏烷類化合物，其中 C13 即茄尼酮［16，17］。

類黑松烷巨環(huán)雙萜烯及其降解產(chǎn)物對(duì)煙草的香味有重要作用，有人認(rèn)為其前身是西柏烯。1975年，斯伯林格等對(duì)黑松－2，7，11－三烯－4，6－二醇作了同樣研究。研究表明類黑松烷巨環(huán)雙萜烯均具旋光性，且黑松－2，7，11－三烯－4，6－二醇是新鮮煙葉蠟質(zhì)的主要成分，它在煙葉調(diào)制、醇化過程中有四種降解途徑:羥基氧化為羥酮或二酮類化合物;羥基氧化脫氫成為四烯醇;羥基氧化脫氫成為四烯醛;C18二烯氧化還原成為羥基酮酸。羥基酮酸和四烯醛類都是茄酮的前體?？緹?、白肋煙、香料煙中都有類黑松烷巨環(huán)雙萜烯及其降解產(chǎn)物的存在，它們對(duì)煙草的香味有重要作用。

3 萜烯類化合物的分析方法

3.1 萜烯類化合物分離提取

現(xiàn)今植物萜類化合物的提取主要包括溶劑提取法、堿提取酸沉淀法和吸附法三大類［1］。分離純化主要包括凝膠柱層析、硅膠柱層析、大孔吸附樹脂層析、反相柱層析、超臨界流體提取、制備型高效液相分離等技術(shù)。

溶劑提取法是國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的方法，可分為苷類化合物和非苷類化合物的提取。前者用甲醇或乙醇作溶劑提取，減壓濃縮轉(zhuǎn)溶于水，將水中不溶性雜質(zhì)濾除，然后用乙醚或石油醚萃取，將殘留的樹脂類等脂溶性雜質(zhì)除去，再用正丁醇萃取，減壓回收正丁醇后即得粗總苷。后者與前者的溶劑一致，減壓回收醇液到無醇味，然后殘留液再用乙酸乙酯萃取，接著回收溶劑得總萜類提取物，或用不同極性的有機(jī)溶劑按極性遞增的方法依次分別萃取，得不同極性的萜類提取物，最后進(jìn)行分離。

溶劑提取時(shí)的有機(jī)溶劑包括二氯甲烷、無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、丙酮和石油醚［18～21，37］等。溶劑提取時(shí)，可采用超聲法、滲漉法、室溫浸泡或熱回流提取法，也可以采用超臨界CO2萃取法和索氏提取方法以及水提醇沉法或醇提水沉法等［22］。李會(huì)軍等［23］、吉騰飛等［24］用乙醇作溶劑從金銀花及歐橄欖葉中得到提取物，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，乙酸乙酯部分采用反復(fù)硅膠柱層析進(jìn)行分離、純化，得到兩個(gè)新的裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物。許敏等用甲醇提取植物干燥葉，用正己烷－甲醇、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。萃取部分經(jīng)硅膠柱層析，梯度洗脫，得到20種新的裂環(huán)烯醚萜苷［25～29］。

內(nèi)酯化合物在熱堿液中會(huì)開環(huán)成鹽，而溶于水中。酸化后會(huì)閉環(huán)，析出原內(nèi)酯化合物。堿提取酸沉淀法是利用該特性可提取倍半萜類內(nèi)酯化合物。但是當(dāng)用酸、堿處理時(shí)，可能引起構(gòu)型的改變，應(yīng)引起注意。

吸附方法主要分為兩種。一種為活性炭吸附法，另一種為大孔樹脂吸附法。徐澤紅等［30］、藺建新等［31］、李茂星等［32］、才謙等［33］用不同型號(hào)的大孔吸附樹脂對(duì)植物提取物中裂環(huán)烯醚萜苷類成分的吸附與解吸附能力進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究出樹脂的最佳型號(hào)、最佳的洗脫溶劑和洗脫體積分離純化富集植物中的裂環(huán)烯醚萜苷類成分。

3.2 萜烯類化合物定性定量分析

國(guó)內(nèi)外有關(guān)萜烯類化合物的研究中，其分析方法主要包含高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、電泳法、液質(zhì)聯(lián)用色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用色譜法等。萜類化合物中具揮發(fā)性精油的部分主要采用氣相色譜進(jìn)行分析，而對(duì)非揮發(fā)性的二萜、三萜一般采用HPLC，結(jié)合適宜的檢測(cè)器分析。

高效液相色譜法分離效果好且分析速度快，已成為目前應(yīng)用最為廣泛的液相色譜法，其分離模式與檢測(cè)方法多種多樣，并且可以選擇不同的檢測(cè)器如質(zhì)譜和紫外檢測(cè)器等。白沙等［34］、林鵬程等［35］、孫菁等［36］都使用該方法測(cè)定了秦艽中龍膽苦苷，并檢測(cè)出萜類成分;有人運(yùn)用多波長(zhǎng)法測(cè)定梔子中3類組分，9個(gè)成分的含量［37］。但用液相色譜法存在樣品前處理繁復(fù)、成本高、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)檢測(cè)要求高等缺點(diǎn)。

氣相色譜法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。前人對(duì)銀杏葉提取物中萜內(nèi)酯的分離毛細(xì)管柱氣相色譜條件做了實(shí)驗(yàn)，且用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定了各組分的含量，結(jié)果表明，氣相色譜法的重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度較高。

GC－MS技術(shù)綜合了質(zhì)譜和色譜的優(yōu)點(diǎn)，利用氣相色譜分離混合物中的組分，利用高鑒別能力的質(zhì)譜儀作為色譜流出物的檢測(cè)器，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)分離出來的組分進(jìn)行迅速地定量和定性分析。王駿［37］等對(duì)側(cè)柏葉中萜烯類化合物進(jìn)行萃取，并用GC、GC/MS檢測(cè)。

4 煙草中萜烯類化合物分離與檢測(cè)

4.1 煙草中萜烯類化合物分離提取

煙草中萜類成分的提取主要包括:溶劑萃取法、水蒸氣蒸餾法、頂空分離法、超臨界二氧化碳萃取法、固相微萃取法。

溶劑萃取法是煙草中常用的提取香味物質(zhì)的方法，在萜類成分的提取方面應(yīng)用廣泛。該方法不需要特殊儀器，但萃取效率低，溶劑需要量大，萃取時(shí)間長(zhǎng)。陳章玉等［38］對(duì)云南的煙葉用乙醚提取，并對(duì)其香味成分進(jìn)行了GC/MS分析，共鑒定出50多種成分。

水蒸氣蒸餾法較為穩(wěn)定，但該法需用大量有機(jī)溶劑萃取，處理量較大。冼可法等人［39］對(duì)河南烤煙煙粉做了水蒸汽蒸餾試驗(yàn)，得到的水蒸汽蒸餾中性物經(jīng)氣相色譜分析和專家評(píng)吸，得出組成復(fù)雜的結(jié)論。

頂空分析法步驟簡(jiǎn)單，處理方便，但在常溫下分離，需要較長(zhǎng)的時(shí)間。由于存在提取不完全的可能性，所以對(duì)香味物質(zhì)的定量分析不準(zhǔn)確。

對(duì)于具有良好香氣的煙草，超臨界流體萃取(SCFE)技術(shù)具有明顯的優(yōu)越性。但SCFE目前缺乏充分的數(shù)據(jù)資料，其設(shè)備設(shè)計(jì)、過程設(shè)計(jì)、經(jīng)濟(jì)預(yù)算等通常是憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行，且投資大、運(yùn)行費(fèi)用高。

固相微萃取技術(shù)的原理與氣相色譜的原理相似，其優(yōu)點(diǎn)是不需要溶劑，分析速度快，操作步驟少。劉江生等人［40］采用固相微萃取—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜(SPME—GC—MS)法定性分析煙葉和成品煙的揮發(fā)性香味成分，共鑒定煙葉中揮發(fā)性成分29種，成品煙中的20種揮發(fā)性成分。

4.2 煙草中萜烯類化合物分析方法

煙草中萜類化合物的儀器分析方法也有液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法和氣質(zhì)聯(lián)用法等。其中，GC/MS技術(shù)在煙草中用來分析萜類化合物最為廣泛，尤其是電子技術(shù)的飛速發(fā)展，使其功能日漸完善，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。GC/MS可用來對(duì)煙葉表面揮發(fā)物和腺體分泌物的主要組成部分進(jìn)行分析。吳云平［41］等選取不同煙草品種為對(duì)象，研究其葉表面提取物特征，用GC/MS分析，結(jié)果表明，烤煙葉表面提取物主要包括煙堿、新植二烯、腺毛分泌物和烷烴類，且不同品種提取物成分存在差異;也可用來分析煙草中萜類化合物的致香物質(zhì)，對(duì)香氣成分進(jìn)行定性。朱曉蘭等［42］、吳鳴等［43］、唐綱嶺等［44］對(duì)煙草中多種香味成分用GC/MS進(jìn)行定性分析，證明了該分析方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。

5 展望

煙草是一種吸食嗜好品，獨(dú)具特色的吸食香味是人們享受卷煙制品的原由之一。在當(dāng)前，卷煙工業(yè)降焦減害工藝中伴隨香味物質(zhì)的損失已成為煙草行業(yè)亟待解決的問題，如何在降低煙葉有害成分的同時(shí)努力保持卷煙制品的吃味醇和及香氣濃郁，已成為煙草科技工作者的研究重點(diǎn)。通過對(duì)前人相關(guān)萜烯類化合物研究結(jié)果進(jìn)行綜述，筆者認(rèn)為，采用更為有效的烤煙香味物質(zhì)分離分析方法，解析不同生態(tài)條件、不同品種、不同烘烤及醇化工藝對(duì)烤煙中各類香味物質(zhì)、尤其是萜烯類化合物的影響，對(duì)提高卷煙原料中香味物質(zhì)的含量，實(shí)現(xiàn)卷煙降焦減害的同時(shí)，更好地保持煙草特有的香味具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。此外，全面系統(tǒng)了解烤煙中萜烯類化合物及其降解產(chǎn)物，有可能發(fā)現(xiàn)新型煙草香精香料，為卷煙新產(chǎn)品的開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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