王群芳 任力 王迎軍 姚詠嫦 侯思潤

(華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640∥華南理工大學(xué)國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006)

在細胞與細胞、細胞與環(huán)境間的信號傳導(dǎo)中，單糖或含糖類綴合物扮演著重要的角色［1］.Lopina等［2］的研究表明，經(jīng)糖改性的聚乙二醇凝膠不僅支持大鼠肝細胞在凝膠中的長期培養(yǎng)，而且能保持肝細胞的功能.含氨基葡萄糖基團的N－(2－羥基丙基)甲基丙烯酰胺凝膠埋植到大鼠的大腦皮層下，可介導(dǎo)宿主細胞遷移到凝膠中，促進凝膠周圍血管的生成［3］;含氨基葡萄糖單元的超分子凝膠涂敷于大鼠背部皮膚傷口，有助于大鼠皮膚傷口的快速愈合［4］.由此可見，將糖結(jié)合到合成聚合物中是制備生物活性材料的有效途徑.

氨基葡萄糖作為一種天然氨基單糖，是組成糖胺聚糖和透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)單元，具備抗炎、緩解骨關(guān)節(jié)炎疼痛癥狀、改善關(guān)節(jié)功能和阻止骨關(guān)節(jié)炎病程發(fā)展的作用［5－6］.氨基葡萄糖分子中有可反應(yīng)的羥基和氨基，在氨基或羥基上接上雙鍵，通過均聚或與其他不飽和單體共聚可獲得帶有氨基葡萄糖基團的聚合物［7－8］.此外，含糖聚合物還可以通過大分子聚合物與氨基葡萄糖反應(yīng)制備［2，9］.以上手段雖然都成功獲得了含氨基葡萄糖的聚合物，但反應(yīng)過程中使用了有毒試劑或反應(yīng)條件嚴苛，無法實現(xiàn)材料原位成型和細胞三維培養(yǎng).聚乙二醇(PEG)是一種親水、低毒的合成材料，PEG的雙丙烯酸酯(PEGDA)可與細胞混合，經(jīng)光引發(fā)劑引發(fā)、光交聯(lián)固化成凝膠，實現(xiàn)原位成型和細胞轉(zhuǎn)運［10］，但PEGDA凝膠缺乏生物活性和細胞識別信號，不利于細胞與生存環(huán)境間的相互作用［11］，而氨基葡萄糖單元的引入有望改善該材料的生物活性.文中采用水溶性單體N－丙烯酰氨基葡萄糖(AGA)和 PEGDA，以 2－羥基－4－(2－羥乙氧基)－2－甲基苯丙酮(I2959)為引發(fā)劑，通過光聚合技術(shù)制備可原位成型的含氨基葡萄糖單元的水凝膠.文中還考察了光引發(fā)劑質(zhì)量濃度、AGA和PEGDA用量對光交聯(lián)產(chǎn)率和產(chǎn)物溶脹行為的影響;同時通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察了引入氨基葡萄糖后凝膠的形貌.

1 實驗部分

1.1 實驗原料

聚乙二醇，數(shù)均相對分子質(zhì)量10000，廣州天馬精細化工廠生產(chǎn);氨基葡萄糖鹽酸鹽，純度99%，美國Sigma公司生產(chǎn);丙烯酰氯，純度98%，購自上海昊化化工有限公司;2－羥基－4－(2－羥乙氧基)－2－甲基苯丙酮(I2959)，瑞士汽巴公司生產(chǎn).

1.2 實驗過程

1.2.1 PEGDA與AGA的制備

［12］合成PEGDA:稱取0.01mol分量的PEG于500mL三口燒瓶中，加入250 mL甲苯，加熱回流移除水分，并蒸干余下的甲苯，之后加入無水二氯甲烷250mL，充干燥氮氣，在冰水浴條件下滴加無水三乙胺5.6 mL，充分攪拌，然后逐步滴加丙烯酰氯3.2mL，2h后在35℃下反應(yīng)過夜.過濾，漏液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，35℃下真空干燥24h.粗產(chǎn)品經(jīng)透析袋(截留分子質(zhì)量為500 u)在去離子水中透析48 h，冷凍干燥.產(chǎn)品的核磁共振氫譜如下:δ 3.41～3.78(—CH2—CH2—);δ 5.90 ～5.926.16，6.34～6.38(CH2═CH—).根據(jù)核磁共振氫譜結(jié)果計算出不飽和酯取代度［13］，為81%.

參考文獻［14］合成AGA:將8.6 g D－氨基葡萄糖、0.14g亞硝酸鈉和5.528 g碳酸鉀溶解于20 mL水中，在冰水浴條件下緩慢滴加3.6 mL丙烯酰氯，2h后緩慢升至室溫，反應(yīng)24 h;然后加入200 mL 99%乙醇終止反應(yīng)，抽濾除去析出的沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液，得到白色固體.粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠層析柱分離，得白色針狀晶體，其核磁共振氫譜表征結(jié)果如下:δ 6.14～6.22(H8，H9:anti)，δ 5.68 ～5.71(H9，syn)，δ 5.12 ～5.13(H1)，δ 3.36 ～3.86(H2，H3，H4，H5，H6).根據(jù)核磁共振氫譜譜圖中質(zhì)子峰的積分面積可計算H的個數(shù)比:S(H8，H9)/S(H2，H3，H4，H5，H6)=3.00∶6.02;理論值為 S(H8，H9)/S(H2，H3，H4，H5，H6)=3∶6.

1.2.2 AGA/PEGDA凝膠的合成

1g PEGDA溶解在4 g 0.6 g/L I2959水溶液中，PEGDA濃度為20%(質(zhì)量分數(shù))，在此溶液中分別加入AGA白色固體，其中PEGDA與AGA的加料質(zhì)量比分別為1∶0.05、1∶0.10、1∶0.20、1∶0.30，在這些質(zhì)量比下得到的AGA/PEGDA凝膠體系依次稱為Gel5、Gel10、Gel20、Gel30，不加 AGA 的稱為 Gel0.然后避光進行磁力攪拌10min，靜置5min，吸取100μL預(yù)聚體溶液，置于聚四氟乙烯制成的φ5mm、深2mm的圓柱形模板中.開啟紫外光固化裝置(型號為MUV－165，主波長為365nm，日本MEJIRO公司生產(chǎn))，在365nm下輻照10min，紫外光輻照強度為0.02W/cm2.

1.3 凝膠的結(jié)構(gòu)和性能表征

1.3.1 預(yù)聚體光聚合前后氫質(zhì)子變化的核磁共振氫譜表征

1g PEGDA溶解在4 g 0.6 g/L I2959重水溶液中，加入AGA，并使混合溶液中PEGDA與AGA最終質(zhì)量比為1∶0.10(Gel10).然后避光磁力攪拌10min，靜置10min，吸取350 μL預(yù)聚體溶液置于石英核磁管中，采用德國Bruker公司的INSTRUM dr×400核磁共振光譜分析儀(1H－NMR)檢測預(yù)聚體溶液的核磁共振氫譜.

取出核磁管，在365nm紫外光下分別輻照5和10 min，對光聚合后體系中的氫質(zhì)子進行核磁共振氫譜檢測.

1.3.2 凝膠的組成和表面形貌表征

光聚合得到的凝膠置于去離子水中浸泡，每4h更換一次新鮮的去離子水，用高效液相色譜檢測更換下來的溶液，直至凝膠內(nèi)殘留單體、AGA均聚物被完全移除，冷凍干燥.采用英國Kratos公司的Axis Ultra DCD型多功能光電子能譜儀(XPS)分析凝膠的表面元素組成和含量，用美國Nicolet公司的NEXUS傅里葉變換紅外光譜儀(FT－IR)表征其組成，用荷蘭Philip公司的XL 30掃描電子顯微鏡(SEM)表征其表面形貌.

1.3.3 凝膠的溶脹性能分析

冷凍干燥凝膠，稱重，標(biāo)記為mi;將干燥凝膠樣品浸泡在去離子水中，每4 h更換一次新鮮的去離子水，在37℃下溶脹48h，用吸水紙蘸掉水凝膠表面的水，稱重，標(biāo)記為ms;完全溶脹的水凝膠置于冷凍干燥機中干燥48h，之后稱量干燥凝膠，標(biāo)記為md.凝膠的溶脹率Q=(ms－md)/md;交聯(lián)產(chǎn)率y=(md/mi)×100%.溶脹率和交聯(lián)產(chǎn)率的計算都采用3個平行樣，計算每個不同凝膠組別的平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 核磁共振氫譜分析

預(yù)聚體溶液中包括PEGDA、AGA和光引發(fā)劑，經(jīng)365nm紫外光輻照發(fā)生交聯(lián)共聚反應(yīng)，如圖1所示.

圖1 PEGDA、AGA光交聯(lián)聚合反應(yīng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of photopolymerization of AGA and PEGDA

圖2給出了不同光照時間下Gel10的核磁共振氫譜譜圖，由圖2可看出，光照0 min情況下有明顯的端烯基吸收峰，這端烯基來自于PEGDA中的丙烯酸酯基和AGA中的丙烯酰基.δ 5.90～6.38對應(yīng)于PEGDA中的6.09～6.24和5.67～5.68對應(yīng)于AGA中的溶液經(jīng)365nm紫外光輻照5 min后，吸收峰的峰型變寬，并且鈍化，δ 5.68～6.38處的吸收峰強度明顯減弱，這是因為體系中已有凝膠形成，流動性變差，分辨率下降.輻照10min后，體系中δ 5.68～6.38處的吸收峰完全消失，該結(jié)果表明體系中PEGDA和AGA的碳碳雙鍵發(fā)生光聚合形成了交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時，體系中PEG鏈段的—CH2—CH2—吸收峰進一步寬化，說明體系已固化成凝膠.

圖2 不同光照時間下Gel10的核磁共振氫譜圖Fig.2 1H－NMR spectra of Gel10 at different time

2.2 AGA/PEGDA凝膠的FT－IR分析

Gel0和 Gel10凝膠的 FT－IR譜如圖3所示，Gel0各峰歸屬如下:3512 cm－1處為PEGDA中未被取代的羥基產(chǎn)生的伸縮振動吸收峰，2910cm－1歸屬于PEGDA中—CH2—CH2—鏈節(jié)的C—H伸縮振動吸收峰，1720 cm－1歸屬于PEGDA中酯鍵的C═O伸縮振動吸收峰，1110 cm－1處為分子鏈中C—O的伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰.除了上述與PEGDA有關(guān)的吸收峰外，Gel10出現(xiàn)了兩處新的吸收峰，1650和1550cm－1分別歸屬于AGA單元中酰胺鍵的吸收Ⅰ帶和吸收Ⅱ帶.AGA/PEGDA干凝膠中出現(xiàn)酰胺鍵特征吸收峰，證明了凝膠網(wǎng)絡(luò)中氨基葡萄糖基團的存在.此外，譜圖中Gel10的羥基吸收峰向低波數(shù)方向移動，在3450cm－1處出現(xiàn)一個寬的吸收峰，這是因為氨基葡萄糖單元上的羥基與PEG鏈中的氧、糖單元羥基與羥基之間形成了氫鍵.

圖3 Gel0和Gel10凝膠的FT－IR譜圖Fig.3 FT－IR spectra of Gel0 and Gel10

2.3 AGA/PEGDA凝膠的XPS分析

圖4 Gel0和Gel10凝膠的XPS能譜圖Fig.4 XPS spectra of Gel0 and Gel10 gels

圖4所示為Gel0和Gel10凝膠的XPS全譜.Gel0在結(jié)合能為285和532 eV附近分別出現(xiàn)C元素峰和O元素峰.Gel10除了在此兩處出現(xiàn)C、O元素峰外，在399eV處出現(xiàn)了N元素峰.Gel0和Gel10凝膠表面的化學(xué)組成如表1所示.從表1可看出，Gel10凝膠表面的N元素原子數(shù)百分含量為0.871%.N元素來源于共聚合單體AGA，這一結(jié)果進一步證明AGA成功接入了 PEGDA交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中;此外，Gel10凝膠表面的C元素原子數(shù)百分含量比Gel0增加了約1.0個百分點，而氧元素原子數(shù)百分含量減少約1.9個百分點.在AGA基團中有9個碳、6個氧、1個氮，在AGA基團中C和O的原子個數(shù)比為1.5∶1，Gel10凝膠表面C、O元素原子數(shù)百分含量的變化應(yīng)與共聚網(wǎng)絡(luò)中引入了AGA有關(guān).

表1 Gel0、Gel10凝膠的表面元素原子數(shù)百分含量Table 1 Surface atomic percentages of Gel0 and Gel10 %

2.4 引發(fā)劑質(zhì)量濃度、PEGDA和AGA用量對凝膠性能的影響

2.4.1 引發(fā)劑質(zhì)量濃度對凝膠溶脹率和交聯(lián)產(chǎn)率的影響

I2959是光交聯(lián)技術(shù)封裝細胞或生長因子常用的水溶性引發(fā)劑［10，15］.在 AGA/PEGDA 體系中，設(shè)定入射光強度和光照時間，考察I2959用量對凝膠溶脹率和交聯(lián)產(chǎn)率的影響，結(jié)果列于表2中.體系中I2959質(zhì)量濃度為0.4 g/L時，交聯(lián)產(chǎn)率最低，這是因為引發(fā)劑濃度低產(chǎn)生的自由基數(shù)量少，體系中存留的氧需消耗掉一部分自由基［16］，從而導(dǎo)致體系凝膠化程度較低所致.I2959質(zhì)量濃度為0.6 g/L時交聯(lián)產(chǎn)率最高，隨著I2959用量的進一步增加，交聯(lián)產(chǎn)率反而下降，但高于0.4 g/L時的產(chǎn)率.這是因為增加引發(fā)劑用量時，單位時間內(nèi)產(chǎn)生的自由基數(shù)量增加，在入射光強度不變的情況下，聚合反應(yīng)速率正比于自由基產(chǎn)生的速率，可使體系快速達到交聯(lián).然而，太高的引發(fā)劑質(zhì)量濃度反而會使交聯(lián)聚合產(chǎn)率降低，由于引發(fā)劑本身需要吸收輻射能才能被激發(fā)產(chǎn)生自由基，光能在表層就被吸收以致不能引起下層的聚合.在文中研究實驗條件下，I2959質(zhì)量濃度為0.6 g/L時，AGA/PEGDA體系可獲得最佳的交聯(lián)產(chǎn)率.

從表2還可知，凝膠的溶脹率隨著I2959用量的增加逐漸減小，這是因為凝膠的溶脹行為與體系的聚合速率和交聯(lián)程度密切相關(guān).隨著引發(fā)劑質(zhì)量濃度的增加，體系聚合反應(yīng)速率加快，短期內(nèi)大量單體向聚合物轉(zhuǎn)化，誘發(fā)廣泛的交聯(lián)，導(dǎo)致水在交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的擴散變得更加困難，從而導(dǎo)致溶脹率下降［17］.然而，體系中雙官能團數(shù)量一定時，交聯(lián)程度的提高有限，以致溶脹率下降幅度不大.

表2 I2959質(zhì)量濃度對凝膠溶脹率、交聯(lián)產(chǎn)率的影響1)Table 2 Effects of I2959 mass concentration on swelling ratio and crosslinking yield of gels

2.4.2 PEGDA用量對凝膠溶脹率和交聯(lián)產(chǎn)率的影響

不同PEGDA用量(質(zhì)量分數(shù))對產(chǎn)物交聯(lián)產(chǎn)率和溶脹性能的影響如表3所示.在體系中，PEGDA分子鏈帶有雙丙烯酸酯基團，是大分子交聯(lián)劑，隨著其用量的增加，體系中不飽和雙鍵數(shù)量增加，交聯(lián)點增加，凝膠溶脹率稍有下降，但凝膠的交聯(lián)產(chǎn)率呈先降低隨后增加的趨勢.這是因為PEGDA中存在小部分沒有被丙烯酸酯化的PEG，在溶脹過程中可從凝膠中擴散出來，導(dǎo)致交聯(lián)產(chǎn)率下降，然而 PEGDA為雙官能團單體，隨著其用量的增加，交聯(lián)度增加，體系的交聯(lián)產(chǎn)率相應(yīng)提高.

表3 PEGDA用量對凝膠溶脹率、交聯(lián)產(chǎn)率的影響1)Table 3 Effects of PEGDA dosage on swelling ratio and crosslinking yield of gels

2.4.3 AGA用量對凝膠溶脹率和交聯(lián)產(chǎn)率的影響

不同AGA用量對產(chǎn)物交聯(lián)產(chǎn)率和溶脹性能的影響如表4所示.AGA是共聚體系中單官能團單體，隨著體系中AGA用量的增加，凝膠溶脹率減少.這是因為，共聚合體系中單體數(shù)量增加，聚合速率加快，更多的氨基葡萄糖基團進入到凝膠網(wǎng)絡(luò);而且，氨基葡萄糖基團中的羥基和PEG鏈中的氧可形成分子內(nèi)氫鍵，阻礙水分子的進入，導(dǎo)致所得凝膠溶脹率下降［18］.在所考察的AGA用量范圍內(nèi)，Gel5凝膠的交聯(lián)產(chǎn)率最高，隨著AGA用量的進一步增加，交聯(lián)產(chǎn)率下降，這可能是因為AGA用量的大量增加使體系中未反應(yīng)的殘留單體量也相應(yīng)增加，致使在溶脹過程中殘留單體溶出，從而導(dǎo)致交聯(lián)產(chǎn)率下降.

表4 AGA用量對凝膠溶脹率、交聯(lián)產(chǎn)率的影響1)Table 4 Effects of AGA dosage on crosslinking yield and swelling ratio of gels

2.4.4 不同AGA含量凝膠形貌的SEM分析

PEGDA和AGA/PEGDA冷凍干燥凝膠的表面形貌如圖5所示.PEGDA凝膠表面比較松散、平滑.在AGA/PEGDA凝膠表面出現(xiàn)了皺褶網(wǎng)面，這種皺褶網(wǎng)面形貌與體系中AGA的量密切相關(guān).從圖5可以看出:Gel5表面只是局部有皺褶;Gel10表面的皺褶范圍擴大，但仍有部分表面呈平滑狀;Gel20和Gel30表面全部被覆蓋皺褶網(wǎng)面.由此可知，AGA/PEGDA凝膠表面的形貌變化應(yīng)是體系中AGA單體用量增加，聚合速率加快，表面快速凝結(jié)而收縮所致.

3 結(jié)論

采用紫外光交聯(lián)技術(shù)制備了不同質(zhì)量比的AGA與PEGDA共聚物，核磁共振氫譜結(jié)果顯示AGA與PEGDA以丙烯酰基團中的碳碳雙鍵為動力學(xué)鏈，形成凝膠;FT－IR分析表明了冷凍干燥凝膠中酰胺鍵和羥基的存在，XPS分析結(jié)果進一步證明了凝膠中N元素的存在，由此可知，通過紫外光交聯(lián)技術(shù)可獲得不飽和單糖AGA與PEGDA的共聚交聯(lián)凝膠.文中還考察了AGA/PEGDA體系光交聯(lián)聚合條件，發(fā)現(xiàn):引發(fā)劑I2959質(zhì)量濃度為0.6 g/L的AGA與PEGDA體系交聯(lián)產(chǎn)率最高;凝膠溶脹率隨著AGA、PEGDA用量的增加而降低，體系交聯(lián)產(chǎn)率則隨著AGA用量的增加而減少.鑒于凝膠中帶有氨基葡萄糖單元，光交聯(lián)反應(yīng)可在生理條件下實現(xiàn)原位成型，AGA/PEGDA體系有望用于細胞或藥物轉(zhuǎn)運中.

圖5 不同AGA用量的AGA/PEGDA冷凍干燥凝膠的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM micrographs of the lyophilized gels with different dosages of AGA

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