徐博文，張 琦

（1．珠海出入境檢驗檢疫局，廣東 珠海519015；2．四川農業(yè)大學動物生物技術中心，四川 雅安625014）

動物胃腸道內定居著種類和數(shù)量龐大的微生物群，胃腸道微生物區(qū)系對宿主具有重要的生理作用。研究發(fā)現(xiàn)，附殖在人和動物消化道內的大量微生物，形成復雜而動態(tài)平衡的微生物區(qū)系，這些消化道內微生物區(qū)系對宿主的健康和營養(yǎng)物質的消化吸收有著重要的作用［1］。當動物胃腸道內菌群失去平衡，就會出現(xiàn)菌群失調，使宿主致病。

研究表明，依靠傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法，我們僅能得到環(huán)境微生物總數(shù)的0．1%～10%，遠遠不能滿足微生物生態(tài)學的研究［2］。分子生物學方法在近幾年的長足發(fā)展彌補了微生物研究中的空白。其中，基于16SrRNA及其基因16SrDNA的研究是分子生物學方法中最為重要的組成部分之一。PCR－DGGE技術起初是由Fischer［3］發(fā)明并用于檢測DNA突變，后由 Muyzer［4］首次用于分析土壤的微生物區(qū)系，之后，PCR－DGGE技術便迅速發(fā)展到其他領域微生物多樣性的研究中。應用DGGE技術分析微生物群落時，主要包括兩個方面的內容，一是獲得高分辨率的圖譜，另外就是對圖譜進行合理的生物學解釋。本文簡述了PCR－DGGE的原理及在動物胃腸道菌群多樣性分析中應用，以期為胃腸道菌群的研究提供新思路。

1 PCR－DGGE技術原理

DGGE利用核酸片段在變性條件下不同程度解鏈，使片段在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移速率不同而顯示核酸片段的多樣性。其工作原理就是利用變性劑在聚丙烯酰胺凝膠中形成濃度梯度，來分離一級結構不同的DNA片段。

當DNA雙鏈在含梯度變性劑（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，由于DNA分子堿基對的組成不同，其解鏈所需的變性劑濃度也不同，當某一雙鏈DNA序列遷移至一定位置，并達到其解鏈所需的最低變性劑濃度，開始解鏈。當DNA分子部分區(qū)域解鏈完成后，其遷移速度將會劇減，近乎為靜止不動。隨著變性劑濃度的不斷增高，基因組所有DNA分子全部解鏈并在不同位置形成相互分開的條帶圖譜，從而將不同的DNA片段分離開來。理論上講，變性梯度凝膠電泳可以檢測到只有一個堿基差別的DNA片段。

然而，一旦變性劑濃度達到DNA片段最高的解鏈區(qū)域濃度時，DNA片段會完全解鏈，成為單鏈DNA分子，此時它們又能在膠中繼續(xù)遷移。因此，如果不同DNA片段的序列差異發(fā)生在最高的解鏈區(qū)域時，這些片段就不能被區(qū)分開來。所以，通常為了防止目的序列完全解鏈，我們在設計引物時會在一條引物的5＇端加入一段約有40～60bp的GC序列，稱之為“GC clamp”，其作用就是調節(jié)目的序列的解鏈行為，防止DNA片段完全解鏈，從而使有堿基差別的DNA片段都能夠分開。

依據(jù)變性劑梯度方向的不同，DGGE又可分為垂直DGGE和平行DGGE，前者主要用于確定所要分析樣品的最佳變性梯度范圍，后者主要用于解鏈范圍明確后DNA片段的檢測。

2 PCR－DGGE技術在動物胃腸道菌群多樣性研究中的應用

當前PCR－DGGE技術在微生物分子生態(tài)學的研究主要用于微生物多樣性、相似性、微生物群落動態(tài)、細菌的富集和分離以及基因水平上的微觀差異等方面。其主要研究對象包括海水、淡水、土壤、食品、污染環(huán)境以及動物胃腸道中的微生物。

16SrRNA分子分為V1－V9九個可變區(qū)，之間間隔排列其恒定區(qū)。因其具有高度的保守性、可變性以及長度適中等優(yōu)勢，使得16SrRNA分子序列成為分子生物學研究的熱門，PCR－DGGE技術所研究的序列大多也基于此段序列。其中V1區(qū)，V3區(qū)，V1－V3區(qū)，V3－V5區(qū)，V6－V8區(qū)等序列片段均有被研究人員用于PCR－DGGE技術的研究。有研究人員通過比較16SrRNA中不同區(qū)對DGGE分析的影響，得出在16SrRNA所有區(qū)中，V3區(qū)或者V1區(qū)是用于DGGE分析動物胃腸道菌群最好的區(qū)域，如果需要較長的擴增產(chǎn)物，那么V3～V5區(qū)和V6～V8區(qū)則是比較理想的選擇［5］。

雖然目前對16SrRNA基因的研究已經(jīng)十分成熟，且已經(jīng)廣泛的用于不同細菌種屬的確定和系統(tǒng)發(fā)育進化關系。但是在擴增目的片段時，發(fā)現(xiàn)許多種的核糖體16SrRNA拷貝存在異質性，而這種異質性是由核糖體基因多拷貝和拷貝進化不同造成的。這種異質性導致PCR－DGGE指紋圖譜所能反映的遺傳信息受到了很大的限制。因此，現(xiàn)在很多研究者將目光投向了同樣具有高度保守性和特異性的RNA聚合酶β亞基的基因rpoB和促旋酶B亞單位的基因gyrB。有研究表明，rpoB基因［7］和gyrB基因［8］在一定程度上更能反應細菌菌群的結構和組成。

但是，目前我們對rpoB基因和gyrB基因研究尚不充分，相比于信息量大而全面的16SrRNA基因，其劣勢十分明顯，基于16SrRNA基因的PCRDGGE技術仍將占有主導地位。因此，很多人提出了結合其他分子生物學方法來分析微生物多樣性。例如，F(xiàn)agbola等（2001）將 PCR－DGGE技術結合rep－PCR（細菌基因組重復序列PCR）技術分析從山藥里面提取的炭疽的遺傳多樣性；Enwall等（2009）結合T－RFLP（末端限制性片段長度多態(tài)性）技術分析土壤中脫氮菌群的多樣性；Choa等（2010）結合PCR－SSCP（單鏈構象多態(tài)性分析）技術分析日本兩種傳統(tǒng)魚制品中微生物的多樣性；Jutta等（2008）結合real－time PCR（實時定量PCR）技術分析了隨季節(jié)變化酸菜中乳酸菌的多樣性變化等。同樣，這些分子生物學方法結合PCR－DGGE技術亦可以用于動物胃腸道菌群的多樣性分析。

PCR－DGGE技術極大的改善了人們對于動物腸道微生物菌群的認識。1999年，Simpson等［9］利用DGGE技術研究了豬在不同年齡、不同飼糧時腸道菌群的變化，揭示了不同年齡段豬腸道內的微生態(tài)系統(tǒng)中菌群的多樣性，斷奶前后豬腸道微生態(tài)發(fā)生了較大的改變。該試驗證明了DGGE技術在分析動物腸道微生物多樣性變化規(guī)律上是一種有效的方法。DGGE技術在日糧、年齡、空間等不同變量時動物胃腸道菌群變化中的研究已日漸成熟，研究結果證明了DGGE技術在胃腸道菌群研究領域中的技術優(yōu)勢。2007年，石鵬君等［10］利用rpoB基因和16SrDNA對中國3種山羊瘤胃細菌的多樣性進行了研究，證明了rpoB基因更有利于分析瘤胃菌群的多樣性。國內尚沒有利用gyrB基因分析動物胃腸道菌群的多樣性的報道。PCR－DGGE技術在動物胃腸道菌群耐藥性的分析上有著無可比擬的優(yōu)勢，通過DGGE技術我們可以很清晰的了解抗生素對動物胃腸道菌群的影響，隨著人們對抗生素耐藥性的日益重視，國際上對這方面的研究也是日益成熟完善。例如，環(huán)丙沙星、阿莫西林、萬古霉素、泰樂菌素等眾多抗生素對胃腸道菌群的影響均可以用PCR－DGGE技術加以分析并得到了理想的效果。況煒等（2008）連續(xù)4d對小鼠進行灌服頭孢曲松溶液，利用PCR－DGGE技術結合活菌技術方法評價抗生素引起的腸道菌群失調，得出PCR－DGGE技術可以直觀而靈敏地顯示抗生素處理過程中小鼠腸道菌群的動態(tài)變化，適用于分析抗生素對腸道菌群的影響。我們亦可以分析在動物服用某種微生態(tài)試劑后，其為腸道內微生物菌群的動態(tài)變化，例如，Pieper等（2009）將兩種植物乳桿菌分別于仔豬斷奶前和斷奶期灌服仔豬，通過PCR－DGGE技術分析發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌在仔豬斷奶期灌服，對仔豬腸道健康有著積極的影響。將DGGE技術與具有種屬特異性的引物相結合，可以從種屬水平上檢測微生物區(qū)系的組成，這種方法是研究動物胃腸道菌群含量較少 的 菌 群 的 有 力 手 段［11］。例 如，Janczyk 等（2007）利用PCR－DGGE技術分析仔豬斷奶前后回腸內乳酸菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)仔豬斷奶前后回腸內乳酸菌群有較大的變化，唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）只有在斷奶后兩天出現(xiàn)，卷曲乳桿菌（Lactobacilluscrispatus）只有在斷奶后1～11d出現(xiàn)，而豬源Lactobacillussobrius則是整個過程中最優(yōu)勢菌群。DGGE技術的優(yōu)勢不僅表現(xiàn)在宏觀上可以對動物整個胃腸道菌群的多樣性分析，還表現(xiàn)在可以對某一菌株在不同環(huán)境、不是時間、不同外物影響下，該菌株的基因型變化，以此來分析該菌株的遺傳圖譜、系統(tǒng)發(fā)育樹，研究某一病原菌的來源以及變異情況［12］。

3 小結

動物胃腸道菌群的正常與否直接關系到動物的健康，了解并掌握動物胃腸道菌群的動態(tài)變化是我們了解動物機體的最為直接的手段之一。分析動物生理、環(huán)境、飼養(yǎng)等因素對動物胃腸道菌群的影響，PCR－DGGE技術無疑是一個上上之選。盡管PCRDGGE技術目前尚存在很多不足，例如不同的DNA條帶在DGGE膠中存在共遷移現(xiàn)象［13］，DGGE技術只能分析500bp以下的片段，獲得信息相對較少，分析鑒定細菌存在很大困難，但是其近幾年在各個領域發(fā)揮的不可低估的作用，愈發(fā)的顯示出它在分析動物胃腸道菌群多樣性中不可限量的前景。加之科研人員不斷對DGGE技術進行優(yōu)化，如新式染色 劑 的 使 用，修 補－PCR（Reconditioning－PCR）、DGGEGE（Denaturing gradient gel electrophoresis gel expansion）等方法的出現(xiàn)，為我們研究動物胃腸道菌群多樣性提供了新思路。再結合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、其他現(xiàn)代分子生物學方法以及生物統(tǒng)計學方法，PCR－DGGE技術為我們全面認識動物胃腸道菌群多樣性打下了堅實的基礎，其在未來也將會得到更廣泛的應用。

［1］ Hooper L V，Melissa H W，Anders T，etal．Molecular analysis of commensal host－microbial relationships in the intestine［J］．Science，2001，291（5505）：881－884．

［2］ Randazzo C L，Torriani S，Antoon D L，etal．Diversity，dynamics，and activity of bacterial communities during production of an artisanal Sicilian cheese as evaluated by 16SrRNA analysis［J］．Appl Environ Microbiol，2002，68（4）：1882－1892．

［3］ Fischer S G，Lerman L S．DNA fragments differing by single base－pair substitutions are separated in denaturing gradient gels：correspondence with melting theory［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1983，80（6）：1579－1583．

［4］ Muyzer G，De Waal E C，Uitterlinden A G．Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction－amplified genes coding for 16SrRNA［J］．Appl Environ Microbiol，1993，59（3）：695－700．

［5］ Yu Z，Morrison M．Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR－denaturing gradient gel electrophoresis［J］．Appl．Environ．Microbiol．，2004，70（8）：4800－4806．

［6］ Da Mota F F，Gomes E A，Paiva E，etal．Use of rpoB gene analysis for identification of nitrogen－fixing Paenibacillus species as an alternative to the 16SrRNA gene［J］．Lett．Appl．Microbiol．，2004，39（1）：34－40．

［7］ Suzuki M，Nakagawa Y，Harayama S，etal．Phylogenetic analysis and taxonomic study of marine Cytophaga－like bacteria：proposal for Tenacibaculum gen．nov．with Tenacibaculum maritimum comb．nov．a(chǎn)nd Tenacibaculum ovolyticum comb．nov．，and description of Tenacibaculum mesophilum sp．nov．a(chǎn)nd Tenacibaculum amylolyticum sp．nov［J］．International journal of systematic and evolutionary microbiology，2001，51（5）：1639－1652．

［8］ Simpson J M，Vance J，McCrackenl H，etal．Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16Sribosomal DNA amplicons to monitor changes in fecal bacterial populations of weaning pigs after introduction of Lactobacillus reuteri strain MM53［J］．Appl Environ Microbiol，2000，66（11）：4705－4714．

［9］ Shi P J，Bai Y G，Yuan T Z，etal．Use of rpoB and 16SrDNA genes to analyze rumen bacterial diversity of goat using PCR and DGGE［J］．Acta microbiologica Sinica，2007，47（2）：285－289．

［10］Satokari R M，Elaine E，Vaughan，etal．Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus－specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis［J］．Appl Environ Microbiol，2001，67（2）：504－513．

［11］Mai V，Ukhanova M，Baer D J．Understanding the extent and sources of variation in gut microbiota studies；aprerequisite for establishing associations with disease［J］．Diversity，2010，2（9）：1085－1096．

［12］徐平，余利巖，張利平．應用16SrRNA基因V－2高變區(qū)序列進行鏈霉菌分子分類［J］．生物多樣性，2001，09（2）：129－137．

［13］Myers R M，Stuart G，F(xiàn)ischer1，etal．Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC－clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis［J］．Nucleic Acids Research，1985，13（9）：3131－3145．