盧洪華，李艷春，華樹成

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春130021）

哮喘是一種常見慢性炎癥性疾病，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。由于病因復(fù)雜，表型多樣，多年來單純從基因方面研究并沒有取得哮喘診治方面的突破。基因是源頭，真正發(fā)揮功能的是蛋白質(zhì)。一般來說，機(jī)體在出現(xiàn)病理變化之前，體內(nèi)的蛋白質(zhì)在成分和量方面都會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，因此，以研究疾病相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)揭示哮喘病理狀態(tài)下異常表達(dá)的蛋白質(zhì)以及疾病不同時(shí)期的蛋白變化水平，可以篩選出與哮喘相關(guān)的蛋白標(biāo)志物，特別是可能發(fā)現(xiàn)以往從未被與哮喘相關(guān)聯(lián)的新蛋白，從而有助于哮喘的診斷、病情評(píng)估、預(yù)后的預(yù)測，由此進(jìn)一步開展針對(duì)性的生物治療。本文將主要就哮喘臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)在哮喘研究中的應(yīng)用

目前蛋白質(zhì)組學(xué)依賴的基本技術(shù)是雙向凝膠電泳（2－DE）、質(zhì)譜分析及生物信息技術(shù)。其中質(zhì)譜技術(shù)又包括電噴霧電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI－TOFMS），基質(zhì)輔助激光解析／電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI－TOF－MS）以及表面增強(qiáng)激光解析／電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI－TOF）等［1］。從經(jīng)典的雙向電泳－質(zhì)譜技術(shù)到不依賴膠的SELDI－TOF蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，可根據(jù)所選標(biāo)本類型進(jìn)行選擇。長期以來，因某些標(biāo)本類型所含蛋白量少（如支氣管活檢標(biāo)本），難以應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法予以檢測。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)高通量和定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，以及相關(guān)儀器靈敏度的提高，上述問題已開始得到解決。如TMT和iTRAQ聯(lián)合納米LC MS／MS技術(shù)已經(jīng)用于鼻灌洗液（NLF）［2］和支氣管活檢［3］的研究。

2 標(biāo)本類型的選擇

標(biāo)本類型的選擇對(duì)于哮喘研究的成功與否至關(guān)重要。可供蛋白質(zhì)組學(xué)研究的哮喘標(biāo)本類型包括支氣管肺泡灌洗液（BALF）、誘導(dǎo)痰、呼出氣冷凝液（EBC）、呼出氣（EB）、血漿、鼻灌洗液（NLF）、支氣管肺活檢等。上述標(biāo)本類型應(yīng)用于哮喘研究各具優(yōu)點(diǎn)和不足。

BALF可以反映呼吸道內(nèi)蛋白情況，可發(fā)現(xiàn)氣道重要的病理調(diào)節(jié)因子，但具有較大的侵入性。誘導(dǎo)痰也可反映氣道組織液情況，相對(duì)BALF來說侵入性小，但其需要嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程，且誘導(dǎo)痰易受唾液污染，健康者亦多難以排出足量的痰液用于分析。作為較有價(jià)值的非侵入性檢查手段，EBC和EB可反映呼吸道實(shí)際情況，但因標(biāo)本所含蛋白質(zhì)量少，相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究不多。血漿中蛋白量多，取材容易，可反映疾病不同表型的病理、生理及藥理過程，故該方面研究也較多，但缺點(diǎn)是組織局部的蛋白入血后會(huì)被稀釋，且血中高豐度蛋白的存在會(huì)干擾中低豐蛋白的篩選。NLF主要用于過敏性鼻炎或慢性鼻竇炎的研究，因哮喘同時(shí)累及上、下呼吸道，NLF用于哮喘相關(guān)方面的研究也有所增加。哮喘蛋白質(zhì)組學(xué)最少使用的標(biāo)本是支氣管、肺組織，因其標(biāo)本通常由手術(shù)獲得，且具有很大的侵入性，標(biāo)本中所含的蛋白量不多，故臨床蛋白質(zhì)組學(xué)使用有限。但從科研角度講，支氣管或肺活檢標(biāo)本直接來源于患病部位，對(duì)于篩選哮喘發(fā)病機(jī)制相關(guān)的生物標(biāo)志物較為合適，其研究成果可供日后應(yīng)用于臨床。

3 哮喘臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀

哮喘蛋白質(zhì)組學(xué)研究最初始于動(dòng)物模型，但動(dòng)物模型仍然存在和人類哮喘不一致之處，因此近些年取樣于哮喘患者臨床標(biāo)本的臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究逐漸增加，多用于哮喘疾病診斷或發(fā)病機(jī)制相關(guān)蛋白標(biāo)志物的篩選。Lindahl等最先應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究哮喘BALF，他們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)甲狀腺素，lipocalin－1，cystatin S和IgBF在哮喘患者中表達(dá)增加［4］。NLF主要用于過敏性鼻炎的研究，但也被用于少量哮喘患者的研究［4］。血漿的研究也逐漸增加，Lee等通過研究阿司匹林哮喘患者發(fā)現(xiàn)在阿司匹林刺激后其血漿中包括補(bǔ)體C3a、C4a在內(nèi)的8種蛋白表達(dá)變化明顯，且提示補(bǔ)體與該病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)［5］。Nicole等采用MALDI－TOF方法鑒別哮喘、慢性阻塞性肺疾病與健康者之間的血漿差異蛋白，發(fā)現(xiàn)α2巨球蛋白、結(jié)合珠蛋白、銅藍(lán)蛋白和血紅素結(jié)合片段等在各組間有差異表達(dá)［6］。哮喘患者血漿T淋巴細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些差異蛋白表達(dá)［7］。

誘導(dǎo)痰方面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也多見于報(bào)道，Gray等利用SELDI－TOF方法比較哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性肺纖維化和支氣管擴(kuò)張者之間的痰液蛋白差異，從哮喘患者痰中分離出105種蛋白，其中一種clara細(xì)胞分泌蛋白在各組間有差異表達(dá)［8］。最近，Sina A 等采用鳥槍（shot gun）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及功能和網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)對(duì)哮喘組和健康組的誘導(dǎo)痰進(jìn)行分析，結(jié)果共分離出254種蛋白，其中補(bǔ)體C3a在運(yùn)動(dòng)性哮喘者中選擇性上調(diào)［9］。作為疾病的靶器官或組織，如肺組織或支氣管，因未受到血漿蛋白的影響，故針對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制的研究前景廣闊，但因其取材具有明顯的侵入性，在全世界范圍內(nèi)哮喘方面的研究還很少。目前哮喘臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究已產(chǎn)生一些蛋白標(biāo)志物，但所篩選出的蛋白仍處于研究階段，尚需臨床進(jìn)一步評(píng)價(jià)來驗(yàn)證其是否具有實(shí)用價(jià)值。另多為通過單純對(duì)比分析哮喘狀態(tài)與健康狀態(tài)之間的蛋白差異得到的結(jié)果，缺少針對(duì)哮喘不同分型的研究。

4 針對(duì)哮喘表型的臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究是日后的研究方向

已有現(xiàn)越來越多的學(xué)者認(rèn)為，哮喘不是一種單一的疾病，而是一組包括多種癥狀的綜合征。哮喘在臨床上多表現(xiàn)為典型的氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流受限的共同特征，但個(gè)體表現(xiàn)各異，如不同的氣道炎癥類型，不同的過敏激發(fā)物，對(duì)特異的環(huán)境暴露如運(yùn)動(dòng)或藥物等敏感，這種差異很可能是不同的病理生理過程所致的不同表型，從而可以解釋其不同的臨床經(jīng)過和治療反應(yīng)。目前，哮喘蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)產(chǎn)生大量候選疾病標(biāo)志物，但很少被進(jìn)一步確證，更少被應(yīng)用于臨床，一個(gè)主要原因是缺少針對(duì)不同表型的研究。不同的表型可能有不同的分子發(fā)病機(jī)制。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究哮喘表型的意義在于，通過比較不同表型之間的蛋白差異，可以發(fā)現(xiàn)針對(duì)不同表型的特異的蛋白標(biāo)志物，進(jìn)一步評(píng)估及預(yù)測病情進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，加深對(duì)發(fā)病機(jī)制的理解，進(jìn)而針對(duì)性治療。

以往普遍認(rèn)為，過敏性哮喘和非過敏性哮喘為哮喘的主要表型。近年來，哮喘各種表型逐漸被提出［10］，也產(chǎn)生了不同的哮喘表型分類和鑒別方法［11－14］。由于部分表型患者數(shù)量有限和臨床分型的難度，哮喘表型的臨床蛋白質(zhì)組學(xué)方面研究相對(duì)較少，但已有逐漸增多的趨勢(shì)。已有學(xué)者研究間歇發(fā)作哮喘［15］和阿斯匹林哮喘［5］。預(yù)計(jì)未來應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，針對(duì)哮喘的不同表型尋找疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，將有助于針對(duì)哮喘不同表型進(jìn)行個(gè)體化治療。

5 展望

目前，哮喘蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，相關(guān)蛋白標(biāo)志物逐漸被發(fā)現(xiàn)，但仍很少應(yīng)用于臨床。因此，通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法，針對(duì)不同表型進(jìn)行研究，以尋找哮喘相關(guān)蛋白標(biāo)志物具有臨床應(yīng)用前景。因哮喘表型各異，應(yīng)仔細(xì)選擇研究對(duì)象并予以恰當(dāng)分類，并結(jié)合具體研究目標(biāo)選取合適的標(biāo)本類型與相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。如上述條件具備，且操作規(guī)范，有望產(chǎn)生新的有價(jià)值的蛋白標(biāo)志物。此外，應(yīng)加強(qiáng)蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)的關(guān)聯(lián)研究，找出與哮喘病理基因密切相關(guān)的蛋白分子，以開展全新的診斷和治療。

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