（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室，重慶市蔬菜學(xué)重點實驗室，重慶400715）

辣椒屬（Capsicum）起源馴化于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，有5個栽培種：C.annuumL.，C.frutescensMill.，C.baccatumL.，C.chinenseJacquin 和C.pubescensRuiz & Pavon（Kothari et al.，2010），其中C.annuumL.是亞熱帶和溫帶地區(qū)栽培最廣泛的種。辣椒在我國的種植面積居蔬菜作物第2位，有著重要的社會意義和經(jīng)濟意義（馬艷青，2011）。

辣椒對各種生物和非生物脅迫敏感，其產(chǎn)量和品質(zhì)受環(huán)境脅迫、病蟲危害等威脅嚴(yán)重。傳統(tǒng)的育種方法周期較長，而且辣椒的遺傳背景相對狹窄，一些性狀在自然界中很難被發(fā)現(xiàn)，難以通過傳統(tǒng)的育種方法獲得具有較強適應(yīng)性的辣椒新品種。利用植物離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進行辣椒植株性狀改良，培育新品種，可以克服物種間基因交流障礙，并且性狀改良針對性強、目的明確，具有較高的研究價值和應(yīng)用價值。通過離體培養(yǎng)實現(xiàn)植株再生，建立穩(wěn)定、高效的離體再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化的先決條件。辣椒屬于再生頑拗型植物，同煙草、番茄、馬鈴薯等其他茄科作物相比，植株再生率低，實現(xiàn)離體再生相對較困難。辣椒離體再生有器官發(fā)生和體胚發(fā)生兩種途徑，器官發(fā)生是辣椒離體再生的常規(guī)途徑，而體胚發(fā)生途徑獲得的再生植株遺傳一致性好，且再生周期短（Kothari et al.，2010）。辣椒體胚發(fā)生是指外植體產(chǎn)生類似合子胚結(jié)構(gòu)的胚狀體（又叫體胚）的過程。體胚經(jīng)發(fā)育、成熟、萌發(fā)、生根可形成再生植株。辣椒體胚發(fā)生又分為直接體胚發(fā)生和間接體胚發(fā)生兩種方式，直接體胚發(fā)生是指外植體直接產(chǎn)生胚狀體；而間接體胚發(fā)生外植體需經(jīng)過愈傷組織階段再產(chǎn)生胚狀體（Nagar，2012）。

本文對辣椒離體培養(yǎng)體胚發(fā)生途徑的相關(guān)研究進行了綜述。由于前人對辣椒花藥和小孢子離體培養(yǎng)體胚發(fā)生的研究做了較多的論述（蘇維和常彩，2010；Solís-Ramos et al.，2011），所以本文關(guān)于體胚發(fā)生的論述中將不再贅述辣椒花藥和小孢子離體培養(yǎng)體胚發(fā)生方面的內(nèi)容。

1 體胚發(fā)生影響因素

1.1 外植體

前人已經(jīng)證實，辣椒下胚軸、未成熟合子胚、成熟合子胚、萌發(fā)合子胚、幼苗子葉、種子子葉及真葉等外植體均能形成體胚（Khan et al.，2006；López-Puc et al.，2006；Zapata-Castillo et al.，2007；Kaparakis & Alderson，2008；Avilés-Vi?as et al.，2012；Nagar，2012）。體胚發(fā)生分為6個時期：原胚、球形胚、橢圓形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚。橢圓形胚有清晰的原形成層，而子葉胚具有頂端分生組織、子葉原基和葉原基。體胚發(fā)生能力一般用出胚率和平均每外植體出胚數(shù)來衡量，研究者認(rèn)為辣椒下胚軸外植體較莖尖、種子子葉、果實切片等外 植 體 出 胚 率 高（Khan et al.，2006；López-Puc et al.，2006；Zapata-Castillo et al.，2007）。López-Puc 等（2006）的研究表明，在黑暗或者16 h 光周期條件下辣椒下胚軸出胚率達100%，幼苗子葉、已萌發(fā)合子胚體胚發(fā)生率都在80%以上，而合子胚出胚率僅為40%～50%。下胚軸平均每外植體出胚數(shù)為175個，但只有去除表皮后才能出現(xiàn)體胚；已萌發(fā)合子胚平均每外植體出胚數(shù)達到87個，且大部分能發(fā)育到魚雷胚時期；幼苗子葉雖然平均每外植體出胚數(shù)只有45個，但能得到更多具有進一步發(fā)育、萌發(fā)能力的體胚；而合子胚平均每外植體出胚數(shù)只有10個；以種子子葉為外植體時，只有子葉切口處的胚性組織產(chǎn)生體胚，且平均每外植體只能產(chǎn)生5個體胚，所以種子子葉最不適合作為體胚發(fā)生的外植體。Kintzios 等（2000）以辣椒幼嫩真葉為外植體時，發(fā)現(xiàn)第1、2片葉比第2片葉產(chǎn)生的體胚多，但是葉的生長位置對體胚從球形胚至子葉胚或者魚雷胚時期的發(fā)育無影響。Zapata-Castillo 等（2007）研究發(fā)現(xiàn)辣椒果實切塊不能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，節(jié)間、節(jié)和下胚軸外植體都能產(chǎn)生愈傷組織，但只有下胚軸外植體才能產(chǎn)生體胚。

Santana-Buzzy 等（2009）、Solís-Romos 等（2010）和Avilés-Vi?as 等（2012）分別以下胚軸和成熟合子胚為外植體，對辣椒體胚發(fā)生進行了解剖學(xué)研究。以下胚軸為外植體時，原形成層細胞經(jīng)48 h 培養(yǎng)之后形成胚性細胞，經(jīng)過急劇有絲分裂形成分生組織中心，然后沿維管束形成胚性組織，培養(yǎng)10～14 d，下胚軸表皮縱向開裂，裂口處出現(xiàn)乳脂色的胚性細胞團，之后可觀察到不同發(fā)育時期的體胚；而以合子胚作為外植體時，表皮的遠軸端先開始有絲分裂，增殖生成瘤狀組織，瘤狀組織細胞大小相同，細胞核與核仁明顯，細胞質(zhì)濃厚，帶有淀粉粒，細胞壁薄，此瘤狀組織即為胚性愈傷組織，胚性愈傷組織的邊緣出現(xiàn)分生組織細胞，經(jīng)進一步分裂形成原胚。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

研究者們多用MS 培養(yǎng)基作為辣椒外植體體胚發(fā)生的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，體胚誘導(dǎo)、發(fā)育和萌發(fā)也可選用固體、半固體、液體MS 培養(yǎng)基（Kintzios et al.，2000；Steinitz et al.，2003；Zapata-Castillo et al.，2007；Solís-Romos et al.，2010；Avilés-Vi?as et al.，2012）。間接體胚發(fā)生誘導(dǎo)愈傷組織時有些研究者選用固體MS 培養(yǎng)基（Kintzios et al.，2000，2001；Zapata-Castillo et al.，2007），也有研究者選用半固體MS 培養(yǎng)基（Solís-Romos et al.，2010）。Zapata-Castillo等（2007）的研究表明，MS 培養(yǎng)基由于無機鹽含量較SH、B5、D 培養(yǎng)基高，所以胚性愈傷組織產(chǎn)生量較大，而B5培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生胚性愈傷組織。Aboshama （2011）比較了WPM和MS 兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基對辣椒體胚發(fā)生的效果，試驗結(jié)果表明WPM 培養(yǎng)基的平均每外植體出胚數(shù)顯著高于MS 培養(yǎng)基；由于WPM 與MS 兩種培養(yǎng)基的磷含量與鈣含量相近、氮含量不同，所以推測基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮含量是辣椒體胚發(fā)生的重要影響因素之一；試驗結(jié)果還表明1/2 MS 培養(yǎng)基比MS 培養(yǎng)基更有利于辣椒體胚的萌發(fā)。

1.3 生長調(diào)節(jié)劑及其他物質(zhì)

外源生長素2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）可以促進胚性細胞的極化，也是外植體合成內(nèi)源生長素的一個刺激因子，所以2，4-D 對辣椒體胚發(fā)生起決定作用，但體胚發(fā)生后高濃度的2，4-D 會阻止體胚的進一步發(fā)育（López-Puc et al.，2006；Zapata-Castillo et al.，2007）。辣椒外植體間接體胚發(fā)生時誘導(dǎo)胚性愈傷組織需要較高濃度（2 mg·L-1）的2，4-D，而胚性愈傷組織的解聚和增殖則需要將2，4-D 濃度降低一半（Kintzios et al.，2001；Zapata-Castillo et al.，2007）。Solís-Ramos 等（2010）在半固體MS 培養(yǎng)基中加入1.65 mg·L-1萘乙酸（NAA）、2 mg·L-1吲哚乙酸（IAA）和2 mg·L-16-芐氨基嘌呤（BA），也成功誘導(dǎo)合子胚外植體產(chǎn)生胚性愈傷組織。Zapata-Castillo 等（2007）的研究表明，誘導(dǎo)胚性愈傷組織產(chǎn)生體胚需用苯基噻二唑基脲（TDZ）替換掉2，4-D；TDZ 不僅能促進體胚形成，還能促進體胚發(fā)育和萌發(fā)，且能使所有胚性愈傷組織形成體胚。Kintzios 等（2001）則用2.9 mg·L-1BA+2 mg·L-12，4-D 誘導(dǎo)胚性愈傷組織產(chǎn)生體胚。直接誘導(dǎo)體胚發(fā)生時，一般采用2 mg·L-12，4-D 誘導(dǎo)體胚（López-Puc et al.，2006；Kaparakis & Alderson，2008；Aboshama，2011），Steinitz 等（2003）則用1 mg·L-12，4-D 誘導(dǎo)辣椒體胚發(fā)生。Avilés-Vi?as 等（2012）將辣椒下胚軸外植體植入2 mg·L-12，4-D 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，繼而轉(zhuǎn)移至1 mg·L-12，4-D 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)15 d，然后再轉(zhuǎn)接至不含2，4-D 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，出胚率達100%，但所得體胚均不能進一步發(fā)育，逐漸畸形、死亡；而將下胚軸外植體在2 mg·L-12，4-D 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，然后將2，4-D 濃度降低一半再培養(yǎng)30 d，出胚率雖只有33.2%，但所得體胚均能發(fā)育到子葉胚時期，且能萌發(fā)。Steinitz 等（2003）研究了IAA、NAA、苯乙酸（PAA）、麥草畏（Dicamba）、毒莠定（Picloram）、鹽酸甲氯酚酯（Centrophenoxine）、快殺稗（Quinclorac）等對辣椒體胚發(fā)生的作用，發(fā)現(xiàn)僅有2，4-D、Centrophenoxine 和Quinclorac 3種生長調(diào)節(jié)劑能誘導(dǎo)辣椒體胚發(fā)生。使用2，4-D 和Centrophenoxine 進行辣椒體胚誘導(dǎo)時，出胚率均能達到95%，其中Centrophenoxine可誘導(dǎo)10種基因型辣椒體胚發(fā)生，其中5種基因型的出胚率為82%～100%；而Quinclorac 的誘導(dǎo)效果不如2，4-D 和Centrophenoxine。Kaparakis 和Alderson（2008）比較了BA、玉米素（ZT）、激動素（KT）、異戊烯基腺嘌呤（2ip）等細胞分裂素對辣椒直接體胚發(fā)生的影響，發(fā)現(xiàn)KT 和2ip 對辣椒體胚發(fā)生影響不顯著，而BA 與ZT 抑制辣椒體胚發(fā)生。總的來講，這4種細胞分裂素對辣椒體胚發(fā)生抑制效應(yīng)為：ZT ＞BA ＞KT ＞2ip。但是有研究者指出，2 mg·L-1TDZ 對辣椒外植體直接體胚發(fā)生有促進作用，不過其作用效果不如2 mg·L-1的2，4-D 顯著（Aboshama，2011；Nagar，2012）。

辣椒體胚的萌發(fā)則需要在培養(yǎng)基中加入0.38 mg·L-1赤霉素（GA3）（López-Puc et al.，2006；Solís-Romos et al.，2010；Avilés-Vi?as et al.，2012）；Khan 等（2006）則直接在MS 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)辣椒莖段和莖尖外植體體胚萌發(fā)，萌發(fā)率38%～80%。

除添加生長調(diào)節(jié)劑外，也有研究者在誘導(dǎo)辣椒體胚發(fā)生時在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1鹽酸硫胺（Kintzios et al.，2001）或10 mg·L-1鹽酸硫胺+100 mg·L-1肌醇+25 mg·L-1半胱氨酸鹽酸鹽（Zapata-Castillo et al.，2007）。多數(shù)研究者以3%（m∶V，下同）蔗糖為誘導(dǎo)辣椒體胚發(fā)生的碳源（López-Puc et al.，2006；Zapata-Castillo et al.，2007；Solís-Romos et al.，2010；Nagar，2012），不 過 也 有 以7%（Steinitz et al.，2003）、8%（Kintzios et al.，2001）、10%（Kaparakis & Alderson，2008）為蔗糖濃度的，還有研究者在不添加糖的培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)辣椒體胚發(fā)生（Santana-Buzzy et al.，2009）。Aboshama（2011）研究表明，3% 蔗糖與6%蔗糖對辣椒體胚的誘導(dǎo)效果無差異，8%蔗糖的誘導(dǎo)效果最好，但蔗糖濃度大于8%時會因為培養(yǎng)基滲透壓過高而抑制體胚發(fā)生。Steinitz 等（2003）研究表明，培養(yǎng)基中加入活性炭能減輕外植體褐化，但由于活性炭具有吸附性，當(dāng)培養(yǎng)基中加入活性炭時需增大生長調(diào)節(jié)劑的添加量，蔗糖也最好過濾除菌。Quinclorac 由于水溶性很差，其活性會被活性炭完全抑制。Aboshama（2011）研究表明，1.0 mg·L-1AgNO3能夠增加辣椒外植體體胚的出胚率和平均出胚數(shù)，但是AgNO3含量增加至1.5～2.0 mg·L-1時則會降低外植體體胚發(fā)生能力。Kintzios 等（2001）研究了維生素和微量元素對辣椒真葉間接體胚發(fā)生的影響，發(fā)現(xiàn)含有0.5 mg·L-1VB6或者100 mg·L-1肌醇的培養(yǎng)基能產(chǎn)生更多的愈傷組織，而在含有0.1 mg·L-1煙酸的培養(yǎng)基上可產(chǎn)生更多數(shù)量的球形胚，甘氨酸對辣椒愈傷組織的增長和體胚形成的促進作用最小。以MS 培養(yǎng)基為對照，發(fā)現(xiàn)錳為正常含量時，銅增至正常含量的10倍能促進辣椒愈傷組織產(chǎn)生和體胚發(fā)生；而鈷含量增至正常含量的10倍對辣椒體胚發(fā)生的影響同錳含量有關(guān)：當(dāng)錳含量為正常含量的1/10時，球形胚產(chǎn)量增大，否則球形胚產(chǎn)量降低；而當(dāng)錳、鋅、碘等微量元素的含量降低至正常含量的1/10 時對辣椒愈傷組織產(chǎn)生和體胚發(fā)生無顯著影響（Kintzios et al.，2001）。Kaparakis 和Alderson（2008）研究表明培養(yǎng)基中添加10%（V∶V）椰汁對辣椒體胚發(fā)生無促進作用。

1.4 培養(yǎng)條件與預(yù)處理

辣椒體胚發(fā)生多采用25℃、光周期16 h 進行培養(yǎng)（Kaparakis & Alderson，2008；Santana-Buzzy et al.，2009；Aboshama，2011），光 子 流 密 度 為40～50 μmol·L-1·m-2·s-1或200～250 μmol·L-1·m-2·s-1（Kintzios et al.，2000；Khan et al.，2006；Kaparakis &Alderson，2008；Solís-Romos et al.，2010）。不同的是，Avilés-Vi?as 等（2012）采用40～50 μmol·L-1·m-2·s-1連 續(xù) 光 照 培 養(yǎng)，而Kintzios 等（2001）、Steinitz 等（2003）先 采 用 黑暗培養(yǎng)21～28 d 誘導(dǎo)辣椒體胚發(fā)生，然后轉(zhuǎn)至16 h 光周期、250 μmol·L-1·m-2·s-1或10 μmol·L-1·m-2·s-1光子流密度的光照條件下促使體胚發(fā)育和萌發(fā)。

有研究者認(rèn)為在辣椒胚性愈傷組織誘導(dǎo)體胚發(fā)生前或在體胚發(fā)育的較高階段（球形胚或子葉胚）誘導(dǎo)萌發(fā)前，需添加一個預(yù)處理階段。將辣椒胚性愈傷組織在用檸檬酸鉀替換硝酸鉀的MS 培養(yǎng)基上預(yù)處理21 d，然后進行體胚發(fā)生誘導(dǎo)，可促進體胚發(fā)生、發(fā)育和萌發(fā)，推測可能是由于檸檬酸鉀降低了體胚中酚類物質(zhì)的含量從而減輕了其對體胚發(fā)生的抑制作用（Zapata-Castillo et al.，2007）。López-Puc 等（2006）在誘導(dǎo)辣椒體胚萌發(fā)前將子葉胚或魚雷胚在含0.5 mg·L-1ABA 的1/2 MS 液體培養(yǎng)基中黑暗預(yù)處理21 d，并指出只有經(jīng)過此預(yù)處理辣椒體胚才能萌發(fā)出子葉。

1.5 外源體胚發(fā)生相關(guān)基因

BBM（BABY BOOM）、LEC1（LEAFY COTYLEDON 2）、LEC2（LEAFY COTYLEDON 2）和WUS（WUSCHEL）等基因與植物體胚發(fā)生有關(guān)。BBM基因可編碼能誘導(dǎo)分化細胞進行體胚發(fā)生的AP2型轉(zhuǎn)錄因子，AP2型轉(zhuǎn)錄因子是植物體胚發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子（Irikova & Denev，2008）。LEC1、LEC2和WUS則是細胞維持胚性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。LEC1可能建立了一個細胞環(huán)境，這種細胞環(huán)境可以促使胚胎形態(tài)發(fā)生和成熟的相關(guān)基因協(xié)同表達，從而促進胚胎的發(fā)育（Stone et al.，2001）。LEC2可以直接調(diào)控生長素合成基因YUC4的表達，同時還激活了生長素響應(yīng)基因的表達，從而激活了生長素信號途徑（Sandra et al.，2008）。LEC2、WUS則是LEC1上游可調(diào)控細胞向胚性轉(zhuǎn)變的基因（Wang et al.，2009）。LEC2可能通過以下兩種機制誘導(dǎo)體細胞胚胎的發(fā)生：首先，LEC2激活了胚胎發(fā)生相關(guān)基因的表達，從而使體細胞成為“感受態(tài)細胞”；其次，LEC2在“感受態(tài)細胞”中激活了生長素信號傳導(dǎo)途徑，從而促使“感受態(tài)細胞”向胚性細胞轉(zhuǎn)變（Sandra et al.，2008）。Irikova 等（2012）在甜椒基因組中鑒定出了BBM和LEC基因，發(fā)現(xiàn)BBM和LEC在體胚發(fā)生的4個時期大量表達。通過遺傳轉(zhuǎn)化將這些體胚發(fā)生相關(guān)基因?qū)肜苯芬部纱偈估苯吠庵搀w體胚發(fā)生，Solís-Romos 等（2009）通過導(dǎo)入WUS基因，發(fā)現(xiàn)表達WUS基因的辣椒莖段外植體產(chǎn)生了較多的球形胚，但是培養(yǎng)45 d后逐漸壞死。Heidmann 等（2011）將BBM基因轉(zhuǎn)入甜椒，BBM的表達促進了外植體體胚發(fā)生，生成了轉(zhuǎn)基因植株。

2 問題與展望

辣椒體胚發(fā)生中，較難克服的問題就是形成畸形胚和胚難以萌發(fā)?；闻咄ǔＳ?種：一是由成簇的胚在縱端基部連在一起形成的混合胚；二是缺子葉、單子葉、子葉畸形的胚；三是缺少頂端分生組織的胚。這些畸形胚不能進一步發(fā)育、萌發(fā)形成正常植株。Steinitz 等（2003）利用Centrophenoxine 誘導(dǎo)10種基因型辣椒體胚發(fā)生，雖然其中的5種基因型出胚率均達到82%以上，但沒有得到再生植株。推斷體胚發(fā)生再生植株畸形可能源于球形胚時期的發(fā)育紊亂，解決畸形問題要從研究初始培養(yǎng)條件著手。Zapata-Castillo 等（2007）在辣椒體胚發(fā)生前采用預(yù)處理取得一定的效果，初步驗證了Steinitz 等（2003）的推斷，將MS 培養(yǎng)基中的硝酸鉀替換為檸檬酸鉀的預(yù)處理方法促進了體胚發(fā)生且體胚發(fā)育同步性較好，能發(fā)育到子葉胚時期且形態(tài)正常，只是萌發(fā)率較低，僅有20%～30%。關(guān)于改善初始培養(yǎng)條件、減少畸形胚的發(fā)生、提高體胚萌發(fā)率以及植株形成率的研究還需要大量的工作。并且關(guān)于畸形胚發(fā)生和體胚發(fā)育不同步性的機理尚不清楚，Lecona-Guzmán 等（2012）研究了辣椒體胚發(fā)生、發(fā)育過程中蛋白質(zhì)含量的變化，指出子葉胚時期總蛋白含量低可能是植株形成率低的一個重要影響因子。但是關(guān)于辣椒體胚發(fā)生的生理生化機理研究仍處在起步時期，有待大量研究。

從以上論述可知，關(guān)于辣椒體胚發(fā)生途徑植株再生國內(nèi)幾乎未見報道，國際上對于與體胚發(fā)生相關(guān)基因在辣椒中的鑒定以及在導(dǎo)入辣椒外植體后對體胚發(fā)生途徑影響的研究也比較少，對BBM和LEC基因在辣椒中的鑒定目前僅有兩篇報道（Irikova & Denev，2008；Irikova et al.，2012），對BBM和WUS基因?qū)肜苯吠庵搀w對體胚發(fā)生途徑影響的研究也只有兩篇報道（Romos et al.，2008；Heidmann et al.，2011）。對辣椒體胚發(fā)生基因的鑒定以及體胚發(fā)生基因?qū)胪庵搀w對體胚發(fā)生植株再生的影響都有待進一步深入研究。

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