顏鈺 曹穎瑛 姜遠英

(1.福建中醫(yī)藥大學藥學院中藥學教研室，福州 350000;2.第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，上海 200433)

目前對于深部真菌研究最多的是白念珠菌，白念珠菌是威脅人類健康與生命的重要機會致病真菌。隨著廣譜抗生素、器官移植免疫抑制劑的大量使用、艾滋病患者系統性真菌感染增加，白念珠菌感染及病死率逐年上升。針對白念珠菌病的治療藥物目前仍是以氟康唑、伊曲康唑等唑類抗真菌藥物為主導，其次還有多烯類 (兩性霉素B)、丙烯胺類(特比萘芬)以及棘球白素類 (卡泊芬凈)等。與此同時由于長期大量反復治療用藥以及預防性用藥，白念珠菌的耐藥現象日益嚴重。耐藥性的產生已經成為臨床上治療失敗的主要原因。

白念珠菌的耐藥性產生與很多因素有關，目前研究較明確的機制主要包括ATP結合蛋白(ATP-binding cassette，ABC)轉運盒多藥外輸轉運子的編碼基因CDR過度表達［1］，易化載體超家族(major facilitator superfamily，MFS)基因MDR 1的過度表達［2］，以及麥角固醇合成酶編碼基因ERG 11的突變和該酶的過度表達［2］等。隨著對于白念珠菌耐藥機制研究的不斷深入，探索其耐藥性也將為今后新型抗真菌藥物制劑的問世開辟思路。本文就白念珠菌近年來新發(fā)現的耐藥機制研究進展作一綜述。

1 麥角甾醇生物合成通路與唑類耐藥

ERG 3編碼甾醇△5，6-去飽和酶，該酶是麥角甾醇合成途徑后期階段的關鍵酶，能使14-甲基甾醇中間產物轉化成細胞毒性的甾醇14-甲基-3，6-二醇，因此抑制該酶的活性，也會產生對唑類藥物的耐藥［3］。有研究認為在念珠菌和釀酒酵母菌中，ERG 3基因失活后不能生成有活性的甾醇△5，6-去飽和酶，引起真菌細胞內蓄積的甾醇中間產物轉變?yōu)?4-去甲基糞甾醇 (14α-methylfecosterol)，而非14-甲基-3，6-二醇。前者能夠部分地代替麥角甾醇的功能，維持真菌生存。而此時由于真菌不能合成麥角甾醇，所以ERG 3基因失活出現對制霉菌素和兩性霉素B交叉耐藥［4］。

Chau［5］報道的兩株臨床分離的白念珠菌，它們甾醇成分中的△5，6-甾醇脫氫酶的活性是有缺陷的，與唑類敏感的臨床分離株相比，它們在小鼠模型中顯示出了較好的減毒作用，同時還能干擾體內真菌菌絲的形成［5］。

2 鋅簇轉錄因子對耐藥基因表達的調控

白念珠菌中涉及的鋅簇轉錄因子主要有Tac1p、Mrr1p、Upc2p、Cap1p 等，其中轉錄因子Tac1p是第1個被發(fā)現的能調控白念珠菌耐藥基因的轉錄因子，其轉錄活化因子在響應誘導性化學物質刺激時，介導著白念珠菌ABC超家族的耐藥相關基因CDR 1和CDR 2表達的上調，并且在耐藥的白念珠菌中所構成的這些外排泵的過度表達是由于Tac1p功能獲得性突變引起的，有研究發(fā)現點突變N977D是引起TAC 1基因高活性及產生耐藥的重要原因，但其具體機制還有待進一步闡明［6］。

Mrr1p則是白念珠菌中MDR 1表達的核心調節(jié)子，不管是在對于外界環(huán)境誘導引起MDR 1的表達，或是在耐藥菌株中外排泵的過度表達中都是不可或缺的重要因子，Nico Dunkel［7］等人探討了臨床上在其他一些氟康唑耐藥的白念珠菌中導致MDR 1過度表達的主要原因，通過對上述菌MRR 1等位基因的測序，MRR 1獲得性功能突變體的引入，以及白念珠菌雜合以及純合的MRR 1等位基因突變體耐藥性等的研究，結果顯示MRR 1鋅簇轉錄因子確實存在單點突變導致的氨基酸取代。在Mrr1p中的這些氨基酸取代使得轉錄因子被激活，以及獲得性功能突變體的存在伴隨雜合子的缺失，都是導致氟康唑耐藥白念珠菌MDR 1過度表達的主要原因。

Upc2p來自另一家族的鋅簇轉錄因子，可調控麥角甾醇生物合成基因 (ERG 11)的表達，同時介導著麥角甾醇缺失時相關基因的上調。Nico Dunkel等［8］通過對氟康唑耐藥及敏感菌株的ERG 11基因UPC 2等位基因測序，發(fā)現分離出的耐藥菌株中UPC 2的一個等位基因中一個單核苷酸被取代，從而導致編碼蛋白中G648D氨基酸的置換。當敏感菌株中引入突變等位基因時，則會導致ERG 11基因的上調并增加菌株對于氟康唑的耐藥性，首次揭示了UPC 2的獲得性功能突變體能引起ERG 11基因表達增強，從而也增加對于氟康唑的耐藥。

Cap1p是亮氨酸拉鏈家族的成員，主要在白念珠菌中介導氧化應激反應，最近的研究發(fā)現它在白念珠菌細胞內能與耐藥相關基因MDR 1的啟動子結合，Sadri Znaidi等［9］通過應用廣泛基因組定位以及基因表達分析研究顯示，Cap1p除了介導氧化應激反應還具有其他細胞內功能，生物信息學序列分析結果表明Cap1p能識別DNA 5＇-MTKASTMA基序，轉錄組學分析提示Cap1p具有轉錄激活劑的功能，轉錄的高表達普遍伴隨Cap1p與靶標的結合。

Sabrina Schubert［10］等 人 探 討 了 Mrr1p 與Upc2p、Cap1p兩種轉錄因子之間是否存在相互依賴關系，以及 Upc2p、Cap1p是否能單獨介導MDR 1的過度表達及耐藥性的發(fā)生，結果表明Mrr1p和Cap1p這兩種轉錄因子與MDR 1啟動子結合在某些環(huán)境條件下共同介導著MDR 1的表達，從而產生耐藥。

另外 Alix T.Coste［11］等還從白念珠菌中分離出與酵母菌中的Pdr1p、Pdr3p功能同源的鋅族轉錄因子的Cta4p、Asg1p和Ctf1p，它們都具有相同的Zn(2)-Cys(6)DNA結合域，結果表明盡管在白念珠菌中Cta4p、Asg1p和Ctf1p與唑類耐藥性不相關，但能通過PDRE來激活酵母菌中的PDR 5來介導多效耐藥。白念珠菌中Cta4p，Asg1p和Ctf1p的相關功能還有待進一步研究。

3白念珠菌細胞壁在唑類抗真菌藥物耐藥中的作用

細胞壁是真菌細胞的重要結構，其代謝與真菌生長和分裂密切相關，作用是控制細胞內膨脹壓力以維持菌體的完整性，主要含有特殊的甘露聚糖、幾丁質和β-葡聚糖成分，其中，幾丁質是β-(1，4)連接的 N-乙酰葡萄糖胺 (N-Glc-NAC)的鏈狀聚合物，是細胞壁的支架結構。在白念珠菌細胞壁維持基因中，GPI 1和CWH 8被認為與耐藥有關。Armêl Plaine［12］等人通過 Ura-Arg-His基因敲除的方法構建細胞壁相關基因DFG 5、PHR 1、PGA 4、PGA 62等的缺失菌，考察了上述基因缺失菌株細胞壁幾丁質含量及β-葡聚糖含量的變化，還觀察了細胞壁的形態(tài)變化及相關蛋白的表達差異。結果表明，DFG 5、PHR 1、PGA 4和PGA 62基因缺失會降低菌株對卡泊芬凈的敏感性。另外，該研究小組還對未知功能的GPI錨定蛋白Pga31p和 Pga62p在細胞壁組成和結構中的作用進行了探討，研究發(fā)現Pga31p蛋白影響細胞壁結構和組成是在細胞壁生物合成早期發(fā)揮作用，而與之作用相反的Pga62p蛋白更多的介導了卡泊芬凈的耐藥。

Keunsook K.Lee［13］等通過比較正常幾丁質水平的白念珠菌感染的BALB/c小鼠與高幾丁質水平的白念珠菌感染后的小鼠，在感染24 h后，用卡泊芬凈治療的效用。結果顯示，在感染早期，前者的治療效應明顯優(yōu)于后者，并且表現出較少的腎臟損傷。而感染24 h后，后者小鼠的腎臟中能檢測到的幾丁質含量要高于前者的1.6倍，表明在體外，高幾丁質水平的白念珠菌感染后的小鼠對于卡泊芬凈的敏感性顯著下降。另外，研究還發(fā)現，高幾丁質含量的細胞在小鼠體內能獲得低頻率的葡聚糖合酶基因FKS 1突變，該點突變導致了S645Y氨基酸的置換。因此，體內卡泊芬凈抗白念珠菌的效力減弱是由細胞壁中幾丁質含量的增加或是獲得性的FKS 1點突變導致的。

另外，Iuliana V Ene［14］等人探討了宿主碳源對致病真菌細胞壁結構、藥物耐藥性以及毒力的影響，主要是通過比較葡萄糖培養(yǎng)的真菌細胞與乳酸培養(yǎng)的細胞二者細胞壁的差別，應用FS-TEM電鏡觀察了細胞壁的構成、厚度及密度，結合多聚陽離子泄漏的紫外吸收方法考察了細胞壁的理化性質的變化，還比較了它們在滲透壓抗性及適應性的影響，以及對于卡泊芬凈、兩性霉素B、咪康唑等抗真菌藥物的敏感性的影響等，與葡萄糖培養(yǎng)的真菌細胞相比，乳酸培養(yǎng)的真菌細胞表現出對卡泊芬凈及兩性霉素B耐藥，而對于咪康唑則更敏感。上述結果表明碳源 (如乳酸、丙酮酸、油酸、氨基酸等)能顯著影響白念珠菌對于環(huán)境應激的抵抗以及提高對抗真菌藥物 (兩性霉素B)的抗性;而糖類碳源(如半乳糖、果糖、山梨醇等)則顯示出與前者相反的結果。

4 鈣調神經蛋白信號傳導途徑變化及其耐藥機制

鈣調神經蛋白在白念珠菌中是調控毒力、應激反應和抗真菌藥物敏感性的一個關鍵因子，與釀酒酵母相似，白念珠菌的鈣信號途徑同樣構成一個復雜的網絡體系。有研究［15］發(fā)現，藥物、氧化脅迫、高滲、堿性pH等諸多環(huán)境壓力能通過某種未知機制，激活白念珠菌質膜CaCehl-CaMidl復合體，引起胞外鈣大量內流，胞質鈣濃度增加，進而使依賴于Ca2+/鈣調素的鈣調神經磷酸酶活化，活化的鈣調神經磷酸酶能使位于胞質的磷酸化CaCrzlp發(fā)生去磷酸化，從而使其進入核內，激活一系列鈣依賴性基因的轉錄。

RTA 2是鈣調神經磷酸酶通路中調節(jié)白念珠菌對唑類藥物耐藥性的必需基因，Jia等［16-17］通過構建RTA 2高表達菌株，經過藥敏試驗，real time RT-PCR、羅丹明6G外排實驗、GC高分辨率MS等方法對其機制深入研究，發(fā)現RTA 2基因的缺失或者異位高表達能分別增加或降低白念珠菌對唑類抗真菌藥物的敏感性，同時RTA 2基因的缺失還能增加二氫(神經)鞘氨醇的蓄積。結論是RTA 2能夠參與鈣調神經磷酸酶酶介導的唑類耐藥以及白念珠菌鞘氨醇長鏈基的釋放?；谝陨辖Y果，Jia等［18］作了進一步的研究，通過一系列相應缺失菌株的構建，透射電鏡的觀察結果以及免疫組化的應用，發(fā)現鈣激活的鈣調神經磷酸酶通過阻斷氟康唑對質膜的損傷顯著降低了白念珠菌對氟康唑的敏感性，這一過程是通過作用于Rta2p實現的。因此，基于Rta2p在調控氟康唑抗真菌效應時的關鍵作用，Rta2p有望成為抗真菌治療的新靶點。

5 蛋白伴侶Hsp90休克蛋白耐藥機制

熱休克蛋白Hsp90是一種高度保守的分子伴侶，在靶蛋白的折疊、轉運、成熟以及降解的過程中起著關鍵的調節(jié)作用。有研究表明，對于人類最普遍的真菌病原體白念珠菌來說，Hsp90介導其對唑類藥物的抵抗，而Hsp90的抑制劑則能阻斷唑類耐藥的產生［19-20］。

Sheena D.Singh［21］等人對于 Hsp90p 在棘球白素白念珠菌耐藥方面進行了研究，揭示了介導棘球白素耐藥的新機制:Hsp90p抑制后能阻斷鈣調神經蛋白的激活，遺傳性的Hsp90p減少也使得鈣調神經蛋白水平下調。在播散性白念珠菌病小鼠模型中，遺傳性的Hsp90p表達減少能增強棘白菌素的殺菌效力。鈣調神經蛋白是依賴于Hsp90p的棘球白素耐藥中的關鍵介質。

Rebecca S.Shapiro［22］等研究發(fā)現，Hsp90p 可調控白念珠菌從酵母態(tài)向菌絲態(tài)的形態(tài)轉變，并且Hsp90p調控上述溫度依賴的形態(tài)學轉變是通過抑制Ras1-PKA通路發(fā)揮的。毒力實驗研究表明，HSP 90基因缺失型白念珠菌對小鼠毒力下降。最近的研究［23］還顯示，抑制賴氨酸脫乙?；窰da1p和Rpd3p能阻滯Hsp90p介導的對于常用抗真菌藥耐藥性的產生和持續(xù)，揭示了乙?；诜g后階段調控真菌Hsp90p功能中的作用。

6 生物被膜(BF)的形成及其耐藥機制

近些年來，隨著醫(yī)療技術的日益更新，各種體內人工器械，如人工心瓣膜、靜脈插管、導尿管、關節(jié)置換術等的應用，使得生物被膜的形成及其耐藥備受關注。生物被膜是一種微生物聚集群體，是微生物為適應自然環(huán)境有利于生存的一種生命現象。成熟期的白念珠菌生物膜是一個在細胞外基質包裹下的由孢子、菌絲體和假菌絲組成的致密的網狀系統，呈有機的三維結構和廣泛的空間不均一性?；|和生長環(huán)境的不同，生物膜的結構也各不相同［24］。

在生物被膜形成的早期，藥物外排泵的表達、質膜中甾醇的組成的變化以及耐藥菌株的出現都與白念珠菌生物被膜對唑類藥物的耐藥相關［25-26］，其他對于日益增加的生物被膜耐藥的因素還包括:耐藥基因的過度表達 (比如藥物外排泵);生物被膜細胞生長速率或代謝速率的改變;藥物與胞外基質的結合;以及質膜組分的改變或菌株更強的抗氧化能力出現［27］。

Jeniel Nett［28-29］等人探討了 β-1，3 葡聚糖在白念珠菌生物被膜耐藥中的作用，同時對葡聚糖合酶基因FKS 1在棘白菌素類、多烯類以及嘧啶類抗真菌藥物介導的白念珠菌生物被膜耐藥中的作用進行了研究，結果表明白念生物被膜細胞壁改變尤其是葡聚糖的變化與耐藥性的產生是相關的，但這一過程產生的具體機制還有待更深入的研究。FKS 1影響生物被膜對于其他類抗真菌藥物的耐藥可能與介導氟康唑耐藥具有共同的機制。

Anna Bink［30］等采用咪康唑為模型化合物，探討了轉錄因子Efg1在白念珠菌生物被膜體內外對于抗真菌藥物耐藥中的作用，通過對白念珠菌△efg1 sessile細胞研究，結果表明轉錄因子Efg1的缺失能提高這些細胞對咪康唑、兩性霉素B以及卡泊芬凈的敏感性，對氟康唑也有相同的效應;而應用家兔的生物被膜模型，也進一步證實了Efg1在體內介導生物被膜對咪康唑的耐藥中的作用。該轉錄因子有望成為抗真菌藥物防治的新靶標。

7 結束語

白念珠菌耐藥的分子機制復雜多樣，呈現出多靶點多層級水平的變化，針對不同類甚至同一種類的不同種藥物，白念珠菌都可能產生與其相應的耐藥途徑，因此給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)，同時也增加了研究白念珠菌耐藥機制的緊迫性及重要性。目前針對白念珠菌治療方法，各家報道不一，許多抗真菌的新型藥物也在不斷涌現，但具體療效還有待進一步研究及探索。而及時準確的診斷，確定適當的用藥劑量和療程，避免盲目的預防性用藥及合理的聯合用藥，研制針對新的作用靶點的抗真菌藥物等都能有效地防治耐藥性的產生。

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