蔡尤佳，劉曉蘭，鄭喜群

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院黑龍江省高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

據(jù)調(diào)查，血栓引起的心腦血管疾病正日益嚴(yán)重地危害人們的健康，已成為人類主要?dú)⑹种?。目前臨床應(yīng)用的治療血栓性疾病的溶栓劑主要有尿激酶、鏈激酶、組織型纖溶酶原激活物等。但它們都存在著不同程度的不足，如半衰期短、抗原性強(qiáng)、副作用較大、價格昂貴等，很難成為大眾藥品。自日本學(xué)者須見洋行等[1]從日本傳統(tǒng)食品納豆中提取出具有纖溶活性的納豆激酶以來，從微生物發(fā)酵膳食中尋找和開發(fā)抗栓及溶栓性保健食品已受到各國科學(xué)家的普遍重視[2]，如從韓國傳統(tǒng)食品Chungbook-Jang 和Doen-Jang 中提取的纖溶酶CK 和Subtilisin DJ-4[3-4]，從中國大豆食品豆豉中分離到的豆豉纖溶酶[5]，以及從蛹蟲草液體發(fā)酵物中提取得到的真菌纖溶酶[6]等。這些從食源性食品中發(fā)酵得到的具有纖溶活性的酶，可催化血纖維蛋白水解，溶解血栓骨架蛋白，使血栓溶解[7]。將食源性食品中得到的纖溶酶，開發(fā)成口服性保健食品，不僅可以預(yù)防心腦血管疾病的生成，安全性能好，易于吸收，而且成本較低，這些優(yōu)點(diǎn)對預(yù)防血栓疾病的保健食品的研究和開發(fā)具有重大的推動作用。

本實驗室以小米粉培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，采用液體深層發(fā)酵方法培養(yǎng)嗜酸放線菌701，經(jīng)檢驗上層發(fā)酵液具有較強(qiáng)的纖溶活性。嗜酸放線菌（Acidophilic actinomycetes）為放線菌（Actinomycetes）中的鏈霉菌屬，為非致病菌，廣泛分布于酸性環(huán)境中，尤其是土壤中[8-9]。它們產(chǎn)生耐酸的胞外酶，如幾丁質(zhì)酶、淀粉酶、蛋白酶等[10]。本研究首先采用單因子實驗對放線菌701 發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶所需的碳源、氮源及金屬離子等因素進(jìn)行篩選，運(yùn)用Plackett-Burman 設(shè)計試驗和Box-Behnken 響應(yīng)面分析法通過最少的試驗次數(shù)和數(shù)學(xué)建模得到準(zhǔn)確有效的實驗設(shè)計方法，研究因子與響應(yīng)值之間，因子與因子之間的交互影響規(guī)律，預(yù)測最佳點(diǎn)，以達(dá)到提高酶活力的目的，為開發(fā)新的預(yù)防血栓栓塞性保健食品及擴(kuò)大化工藝研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

嗜酸放線菌701（Acidophilic actinomycetes 701），由齊齊哈爾大學(xué)微生物遺傳實驗室選育并保存。

1.1.2 儀器

Sartorius 酸度計：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；新型大容量恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海新蕊自動化設(shè)備有限公司；himac CF15RX 型高速冷凍離心機(jī)：美國；鍍鉻游標(biāo)卡尺：沈陽市第四量具廠。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基為GYM 固體培養(yǎng)基（g/mL）：葡萄糖0.4%，酵母膏0.4%，麥芽浸膏1%，碳酸鈣0.1%～0.2%，瓊脂1.8%，pH6.7。

種子培養(yǎng)基為GYM液體培養(yǎng)基（g/mL）：葡萄糖0.4%，酵母膏0.4%，麥芽浸膏1%，碳酸鈣0.1%～0.2%，pH6.7。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/mL）：小米粉1.7%（經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過80 目篩），葡萄糖2%，碳酸鈣0.2%，氯化鈉0.5%，蛋白胨0.6%，pH4。

1.3 培養(yǎng)方法及粗酶液的制備

斜面培養(yǎng)方法：采用劃線法將放線菌接入GYM 固體斜面培養(yǎng)基中，放置于28℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 d～7d。

種子培養(yǎng)：將活化后的菌種接種到50 mL（250 mL三角瓶）種子培養(yǎng)基中，在溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 下培養(yǎng)30 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按5%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量將上述種子液接入到50 mL（250 mL 三角瓶）發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度22 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min 下培養(yǎng)4 d。

粗酶液制備方法：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在10 000 r/min、4 ℃條件下，離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.4 分析方法

血纖維蛋白平板法（配制5 個平板）：參照Astrup[11]，略有改動。取0.125 g 瓊脂糖加入25 mL 生理鹽水中，加熱溶解后置45 ℃水浴中保溫30 min 后，加入500 U/mL的凝血酶250 μL，混勻。取1 支80 mg/支血纖維蛋白原溶于25 mLHCl-巴比妥鈉緩沖液（pH7.8）中，置45 ℃水浴中保溫5 min。分別取5 mL 凝血酶溶液與5 mL 血纖維蛋白原溶液混合均勻后，迅速倒入φ9 cm 平皿中，水平靜置30 min 后置于冰箱中備用。

放線菌纖溶酶活力測定：用10 μL 發(fā)酵液在血纖維蛋白平板上的溶圈面積表示纖溶酶活。取待測酶液10 μL 加樣于血纖維蛋白平板上，37 ℃保溫6 h，測定溶圈直徑，計算面積，纖溶酶活力與溶圈面積正相關(guān)。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響

本研究以本課題組前期通過單因素實驗優(yōu)化確定的碳源（2%葡萄糖）、搖床轉(zhuǎn)速（160 r/min）、接種量（5%）、培養(yǎng)溫度（22 ℃）為基礎(chǔ)[12]，對嗜酸放線菌701深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶發(fā)酵條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.1 小米粉濃度對纖溶酶活力的影響

小米營養(yǎng)豐富，除含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類以外還含有鈣、磷、鐵、鋅、鎂、VA、VE、煙酸等多種營養(yǎng)因子，在發(fā)酵過程中提供碳氮源的同時還可以提供豐富的礦物質(zhì)及生長因子，為放線菌產(chǎn)纖溶酶提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。對放線菌產(chǎn)纖溶酶所需的小米粉濃度進(jìn)行篩選的實驗結(jié)果見圖1。

圖1 小米粉濃度對纖溶酶活力的影響Fig.1 Effect of millet concentration on the fibrinolytic enzyme activity

如圖1 所示，小米粉濃度為1%時放線菌產(chǎn)纖溶酶活力最大，達(dá)到129.43 mm2/10 μL。通過實驗得知，當(dāng)小米粉濃度較低時，纖溶酶活力較低，可能是由于反應(yīng)體系中的營養(yǎng)物質(zhì)不夠充足，不能滿足放線菌產(chǎn)纖溶酶的需求。當(dāng)小米粉濃度過高時，由于小米粉水溶性較差，可能影響了培養(yǎng)基中的溶氧量，在發(fā)酵結(jié)束后小米粉沒有完全被消耗利用，影響纖溶酶的生成。

2.1.2 氮源對纖溶酶活力的影響

氮源主要是提供合成原生質(zhì)和細(xì)胞其它結(jié)構(gòu)的氮素來源，是影響微生物產(chǎn)酶的重要因素。不同類型的微生物利用的氮源差異較大，選擇合適的氮源對微生物的生長及代謝過程有重要的影響[13]。本實驗以2 %的葡萄糖，1%的小米粉為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，分別加入濃度為0.6%的蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸膏、黃豆餅粉、牛肉膏、硝酸鉀、硝酸銨和尿素作為氮源，考察不同種類氮源對產(chǎn)酶的影響。

圖2 氮源對纖溶酶活力的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on the fibrinolytic enzyme activity

如圖2 所示，對放線菌產(chǎn)纖溶酶活力影響較大的依次為牛肉膏、蛋白胨和酵母浸膏，這與Chitte R R 報道的以蛋白胨為氮源產(chǎn)纖溶酶活力比以酵母浸膏為氮源產(chǎn)纖溶酶活力高相一致[14]。其中有機(jī)氮中的牛肉膏對放線菌產(chǎn)纖溶酶的影響最大，酶活力最大達(dá)到183.92 mm2/10 μL。這可能是由于牛肉膏中含有含氮和非含氮兩類物質(zhì)[15]，其中含氮物包括：肌酸、甘氨酸、黃嘌呤等，非含氮物包括：糖原、生物素、葉酸、無機(jī)鹽等，這兩類物質(zhì)可以補(bǔ)充蛋白胨營養(yǎng)成分的不足，為放線菌提供氮源的同時還提供能源及生長因子，更好的促進(jìn)放線菌產(chǎn)纖溶酶。

2.1.3 金屬離子對纖溶酶活力的影響

培養(yǎng)基中金屬離子的主要功能在于它可以作為酶的組成部分或維持酶的活性，促進(jìn)菌體生長，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基及發(fā)酵液的滲透壓、pH 和氧化還原電位等[16]。因此需對培養(yǎng)基中金屬離子及其加量進(jìn)行優(yōu)化，研究它們對產(chǎn)酶的影響。以2%葡萄糖、0.6%牛肉膏、1%小米粉作為培養(yǎng)基，分別加入0.02 mol/L（經(jīng)單因素實驗優(yōu)化后確定）CaCO3、NaCl、KCl、MgSO4、FeSO4，以不加金屬離子組作為對照，考察不同金屬離子對纖溶酶生成的影響，結(jié)果見表1。

表1 金屬離子對纖溶酶活力的影響Table 1 Effect of metal ions on the fibrinolytic enzyme activity

如表1 所示，CaCO3和NaCl 對放線菌產(chǎn)纖溶酶活性有明顯的促進(jìn)作用。其中CaCO3的添加對產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，可能是因為Ca2+作為蛋白酶的激活劑和穩(wěn)定劑，同時CaCO3可中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸，從而控制發(fā)酵液pH 的穩(wěn)定性，保護(hù)酶的活性[17]。NaCl 是保持細(xì)胞外液滲透壓和容量的重要成分，對調(diào)節(jié)細(xì)胞的酸堿平衡具有重要的作用。其它金屬離子對產(chǎn)酶均有不同程度的抑制作用。其中鐵離子完全抑制纖溶酶的活性，可能是鐵離子與酶蛋白的某些特殊基團(tuán)相結(jié)合，引起酶構(gòu)象的改變，從而導(dǎo)致其生物學(xué)功能的喪失。鎂離子作為參加酶促反應(yīng)的重要輔助因子，是許多種酶的激活劑，但在嗜酸放線菌產(chǎn)纖溶酶的代謝過程中，沒有起到促進(jìn)作用，反而抑制了纖溶酶的生成?？赡苁怯捎谑人岱啪€菌在代謝前期積累酸過多，導(dǎo)致酶的生成途徑受到抑制，鎂離子沒有起到激活劑的作用。

2.1.4 裝液量對纖溶酶活力的影響

在發(fā)酵過程中微生物的代謝受多種因素的限制，溶氧量是最易成為限制的因素，影響搖瓶溶氧量的因素為搖瓶的裝液量和搖床的轉(zhuǎn)速。所以在搖瓶發(fā)酵時，需要對裝液量進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳裝液量。以葡萄糖2%、牛肉膏0.6%、小米粉1%、氯化鈉0.5%、碳酸鈣0.2%為培養(yǎng)基，在接種量5%、培養(yǎng)溫度22 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)4 d 的條件下，對發(fā)酵液裝液量進(jìn)行優(yōu)化。以30、50、70、90、110 mL（250 mL 三角瓶）改變裝液量。

圖3 裝液量對纖溶酶活力的影響Fig.3 Effect of liquid volume on the fibrinolytic enzyme activity

實驗結(jié)果如圖3 所示，嗜酸放線菌產(chǎn)纖溶酶最適裝液量為30 mL/250 mL，最大酶活力達(dá)149.28 mm2/10 μL，表明嗜酸放線菌產(chǎn)纖溶酶需要較高的溶氧濃度。這可能是因為在搖瓶發(fā)酵時裝液量越少，單位體積發(fā)酵液的溶氧量越大，放線菌呼吸強(qiáng)度增強(qiáng)，加快其代謝途徑，提高酶的產(chǎn)量。

2.2 Plackett-Burman 設(shè)計法篩選影響產(chǎn)酶的重要因素

Plackett-Burman 設(shè)計法是種部分析因法。根據(jù)單因素試驗的優(yōu)化結(jié)果，選擇培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等8 個因素作為優(yōu)化的輸入因子。試驗選用N=12 的設(shè)計安排，對小米粉（X1）、葡萄糖（X2）、牛肉膏（X4）、碳酸鈣（X5）、氯化鈉（X7）、pH（X8）、裝液量（X10）、接種量（X11）8個因素進(jìn)行考察，每個因素分別取兩個水平，低水平為單因素試驗的結(jié)果，高水平取低水平的1.25 倍，設(shè)計添加3 個空項X3、X6、X9和一個中心點(diǎn)，響應(yīng)值為酶活力（Y）。試驗設(shè)計及實驗結(jié)果見表2。

表2 Plackett-Burman 實驗設(shè)計和結(jié)果Table 2 Experimental design and result of the Plackett-Burman design

運(yùn)用Design-Expert 軟件對表2 的試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，并進(jìn)行方差分析，檢驗結(jié)果見表3。

表3 Plackett-Burman 設(shè)計的各因素水平及效應(yīng)Table 3 The levels and effect of factors for Plackett-Burman design

對產(chǎn)酶的影響最顯著的4 個因素依次為：pH＞牛肉膏＞裝液量＞接種量，其可信度均＞95%，其它幾個因素的可信度均＜95%。說明pH 對嗜酸放線菌的代謝影響特別顯著[18]，嗜酸放線菌701 為中度嗜酸放線菌，對pH 有較嚴(yán)格的要求（控制在4.5 至5.5 范圍內(nèi)[10]）。牛肉膏作為氮源對纖溶酶的生成影響較顯著，據(jù)報道纖溶酶是一種誘導(dǎo)酶[19]，誘導(dǎo)物的存在能增加細(xì)胞的產(chǎn)酶速度，提高酶產(chǎn)量。酶本身又是蛋白質(zhì)，而氮素則是組成蛋白質(zhì)和核酸的主要元素[17]。裝液量主要影響液體培養(yǎng)基中的溶氧濃度，嗜酸放線菌為好氧微生物，增加周圍環(huán)境中的氧至臨界值，可以加強(qiáng)放線菌的呼吸強(qiáng)度。如果溶氧不足，將影響三羧酸循環(huán)中一些氨基酸生物合成的前體的生成，阻礙其它氨基酸與蛋白質(zhì)生物合成，進(jìn)而影響纖溶酶的生成。

2.3 響應(yīng)面分析法確定重要因素的最佳水平

由Plackett-Burman 實驗可知，在放線菌產(chǎn)纖溶酶的發(fā)酵中，pH、牛肉膏、裝液量和接種量為影響產(chǎn)酶的四個顯著因素。因此本試驗以纖溶酶活力為響應(yīng)值，自變量為pH、牛肉膏、裝液量、接種量，分別以X1、X2、X3、X4代表，采用響應(yīng)面分析法確定各因子最佳水平。各因子編碼值及自變量水平見表4、試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)面Box-Behnken 組合設(shè)計的因素及水平Table 4 The value range and levels of factors for RSM Box-Behnken

表5 響應(yīng)面試驗安排及結(jié)果Table 5 Experimental design and result of RSM

利用Design-Expert 軟件對表5 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到纖溶酶的二次回歸方程為：

由回歸系數(shù)的顯著性分析（表6）得知，回歸模型F-檢驗顯著，可見纖溶酶響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ突貧w顯著。

表6 回歸系數(shù)顯著性分析Table 6 The analysis of regression coefficient

由模型方差分析結(jié)果見表7。

表7 模型方差分析Table 7 Analysis of variance on the model

由表7 可知，模型回歸的p=0.001 5，失擬項的p=0.383 5，說明模型失擬不顯著，回歸顯著，不需要引入更高次數(shù)的項，模型適當(dāng)，決定系數(shù)的平方（R-square）為87.88%，表明87.88%的溶圈面積變化可由此模型解釋，二次回歸方程的擬合程度較好，可以用于放線菌產(chǎn)纖溶酶發(fā)酵優(yōu)化的理論預(yù)測。

由于模型回歸顯著，影響纖溶酶活性的因素依次為X1＞X2＞X4＞X3。二次多元回歸方程二次項系數(shù)均為負(fù)，方程表征的拋物面開口向下，有極大值點(diǎn)。回歸方程的響應(yīng)曲面圖及等高線圖見圖4。通過該組圖可對任意兩因素交互影響纖溶酶活力大小效應(yīng)進(jìn)行分析與評價。對放線菌產(chǎn)纖溶酶的二次回歸方程進(jìn)行模擬尋找最優(yōu)值，得到纖溶酶最適發(fā)酵條件為：pH5.32、牛肉膏1.13%、接種量7.1%、裝液量20mL/250mL。在此條件下條件下纖溶酶理論最大酶活力為：233.05 mm2/10 μL。采用上述的最優(yōu)培養(yǎng)基條件進(jìn)行3 次重復(fù)實驗，結(jié)果分別為：229.02、227.70、227.78 mm2/10 μL，平均值為228.17 mm2/10 μL，與預(yù)測值有較好的擬合性，可見該模型可較好預(yù)測實際發(fā)酵情況。在初始培養(yǎng)條件下，發(fā)酵得到纖溶酶活力平均為161.80 mm2/10 μL。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下產(chǎn)纖溶酶活力比初始條件下發(fā)酵所得纖溶酶活力提高41.02%。

圖4 影響纖溶酶活力的重要因素的響應(yīng)面曲線圖Fig.4 Response surface stereogram plots for the effect of important factors on the fibrinolytic enzyme activity

3 結(jié)論

對嗜酸放線菌701 產(chǎn)纖溶酶的液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，首先采用單因素試驗對放線菌產(chǎn)纖溶酶所需的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行篩選并優(yōu)化，得到最優(yōu)的碳源為葡萄糖，氮源為牛肉膏，裝液量為30 mL/250 mL，小米粉最適濃度為1%。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Plackett-Burman 設(shè)計從眾多影響產(chǎn)酶因素中快速有效的篩選出具有主效應(yīng)的因子，分別為pH、牛肉膏，接種量和裝液量。最后采用Box-Behnken 試驗設(shè)計建立多項式回歸二階模型，通過優(yōu)化分析確定各因素的最佳水平。經(jīng)3次試驗驗證在初始pH 為5.32、牛肉膏1.13%、接種量7.1%、裝液量20 mL/250 mL、小米粉1%、葡萄糖2%、氯化鈉0.5%、碳酸鈣0.2%、培養(yǎng)溫度22℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min 條件下培養(yǎng)4 d，嗜酸放線菌701 產(chǎn)生的纖溶酶活力為228.17 mm2/10 μL，較優(yōu)化前提高41.02%。

[1] Fujita M,Nornura K,Hong K,et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme in the vegetable cheese natto,a popular soybean fermented food in Japan[J]. Biochem Biophy Res Commun,1993,197(3):1340-1346

[2] Cheng T W,Bao P J,Bo L,et al.Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33, isolated from Chinese tradition Douchi[J].Ind Microbiol Biotechnol,2006, 33: 750-758

[3] Kim W,Choi K, Kim Y, et al. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. Strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang[J]. Appl Environ Microbiol, 1996,62:2482-2488

[4] Kim S H, Choi N S. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacigus sp.strain DJ-4 screened from Doen-Jang[J].Biosei Biotechnol Biochem,2000,64:1722-1758

[5] 李江偉,冉國俠,陳新梅.豆豉溶栓酶的分離純化及其體外溶栓作用[J].中國生化醫(yī)藥雜志,1999,20(3):148-150

[6] 陳慧鑫,劉曉蘭,李巍巍,等.蛹蟲草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2010(11):216-220

[7] 魯艷莉,寧喜斌.血栓形成機(jī)理及溶血栓藥物的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2006,27(1):169-172

[8] 劉志恒. 放線菌-微生物藥物的重要資源[J]. 微生物學(xué)通報,2005,32(6):143-166

[9] Seong C N,Goodfellow M,Ward A C,et al.Numerical classifieartion of acidophilic actinomycetes isolated from acid soil in Korea[J].Kor J Microbiol,1993,31:355-363

[10] 崔慶峰,王黎明,劉志恒,等.酸性土壤中嗜酸稀有放線菌的多樣性研究[J].微生物學(xué)報,2004,44:571-575

[11] Astrup T, Mullertz S,et al. The Fibrin Plate Method for Estimating Fibrinolytic Activity[J].Arch Biochem Biophys,1952,40:346-351

[12] 韓陽.一株放線菌產(chǎn)纖溶酶的分離純化及菌種初步鑒定[D].齊齊哈爾：齊齊哈爾大學(xué)，2009:15-25

[13] 張文治.新編食品微生物學(xué)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2001:55

[14] Chitte R R, Dey S. Potent fibrinolytic enzyme from a thermophilic Streptomyces megasporus strain SD5[J].Lett Appl Microbiol, 2000,31:405-410

[15] 陳天壽. 微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,1995:99-101

[16] 王建玲,劉逸寒,郝育杰,等.高產(chǎn)堿性果膠酶基因工程菌的發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].工業(yè)微生物,2011,41(3):21-26

[17] 張樹政.酶制劑工業(yè)[M].北京:科學(xué)出版社,1984:115-117

[18] Kim S B,Seong C N,Jeon S J,et al.Taxonomic study of neutrotolerant acidophilic actinomycetes isolated from soil description of Streptomyces yeochonensis sp.nov.[J]. Int J Syst Evol Microbiol,2004,54:211-214

[19] 劉曉蘭, 杜連祥,路福平,等.根霉12 號固體發(fā)酵產(chǎn)生纖溶酶工藝條件的研究[J].菌物系統(tǒng),2003,22(3):481-488