李海紅， 李紅艷

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院， 陜西 西安 710048)

0 引言

農(nóng)作物秸稈作為一種寶貴的可再生資源，由于非水溶性的秸稈木質(zhì)素與半纖維素以共價(jià)鍵結(jié)合形成的緊密結(jié)構(gòu)，將纖維素分子包埋在其中，導(dǎo)致了秸稈的難生物降解特性[1，2]，限制了秸稈的資源化利用.因此，縮短秸稈降解周期的關(guān)鍵是木質(zhì)素的高效降解.目前生物預(yù)處理被證明是木質(zhì)素降解的有效途徑，自然界中可以腐蝕和分解秸稈、樹(shù)葉及樹(shù)木等高纖維物質(zhì)的微生物很多,其中白腐真菌作為一個(gè)龐大的微生物家族，以其特殊的生理生化機(jī)制和強(qiáng)大的降解能力，越來(lái)越引起人們的關(guān)注.

章燕芳等人[3]研究發(fā)現(xiàn)，白腐真菌與其它的微生物相比，在對(duì)木質(zhì)素的降解方面表現(xiàn)出很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì).白腐菌是一類(lèi)絲狀擔(dān)子真菌[4,5]，喜好溫暖濕潤(rùn)的環(huán)境，多見(jiàn)于熱帶雨林的闊葉樹(shù)或針葉樹(shù)的枯木上群生，能夠分泌胞外氧化酶降解木質(zhì)素，被認(rèn)為是最主要的木質(zhì)素降解微生物.而優(yōu)良菌株是分解或轉(zhuǎn)化木質(zhì)素的關(guān)鍵.

為獲得可用于秸稈還田條件下接種、促進(jìn)秸稈快速腐解的白腐真菌，本實(shí)驗(yàn)從眾多朽木上大量取樣,通過(guò)富集培養(yǎng)、劃線初篩以及復(fù)篩鑒定選育出2株具有木質(zhì)素氧化酶的菌株，利用濾紙條和稻草秸稈對(duì)其木質(zhì)纖維素降解能力進(jìn)行研究，得到了具有降解秸稈纖維素和木質(zhì)素的候選白腐真菌，為秸稈的綜合利用提供了工作基礎(chǔ)和理論參考.

1 材料與方法

1.1 菌源

選擇秦嶺南驪寧陜縣未開(kāi)發(fā)森林為樣品采集地點(diǎn)，菌種的采集對(duì)象主要鎖定在多年的朽木上，用刀片將含菌的朽木從表層割下，并用標(biāo)簽標(biāo)記，保存于冰箱中.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 選擇培養(yǎng)基

主要成分：KH2PO4·3H2O 1 g/L；NaH2PO4·7H2O 0.2 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；CaCl20.1 mg/L；FeSO4·7H2O 0.4 mg/L；CuSO4·7H2O 0.2 mg/L；ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L；(NH4)C4H4O60.1 g/L；葡萄糖1 g/L；VB10.1 mg/L；pH 5.5,此培養(yǎng)基又叫專項(xiàng)培養(yǎng)基.

1.2.2 土豆培養(yǎng)基(PDA)

主要成分：馬鈴薯 200 g；葡萄糖 20 g；K2HPO43 g；MgSO4·7H2O 1.5 g；蒸餾水 1 000 mL；pH 5.5；VB1微量.用于菌類(lèi)的增殖擴(kuò)大培養(yǎng).

1.2.3 濾紙條鑒定培養(yǎng)基

主要成分：(NH4)2SO41 g/L；KH2PO4·3H2O 1 g/L；MgSO40.5 g/L；K2HPO42 g/L；酵母膏 0.1 g/L；滅菌后的濾紙條(1*7 cm)一條；蒸餾水1 000 mL；自然 pH.經(jīng)恒溫振蕩培養(yǎng),計(jì)算濾紙失重率.

1.2.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

主要成分：稻草粉(40目)3 g；CaSO40.02 g；MnSO40.06 g；接種量10%；12 mL自來(lái)水；pH 5.5.

配制好的液體培養(yǎng)基加入一定量的瓊脂(1.5～2.0 %)，即1 000 mL加入15～20 g后加熱攪拌，即可得到固體培養(yǎng)基，接種前于121 ℃下高壓滅菌20～30 min.

1.3 實(shí)驗(yàn)與方法

1.3.1 白腐真菌的篩選

(1)初篩：用75 %的乙醇將采集的樣品浸泡3～5 min進(jìn)行消毒處理，陰干后對(duì)腐木的不同部位剪切分離，把得到的腐木小塊混均后，接種到選擇固體平板培養(yǎng)基上，一部分腐木塊與培養(yǎng)基混合培養(yǎng)；一部分均勻撒到培養(yǎng)基表層，形成對(duì)照試驗(yàn)，于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d.

按照白腐菌菌落外形特征、顏色、透明度等,選擇疑似白腐真菌的菌落于PDA固體平板培養(yǎng)基上和選擇固體平板培養(yǎng)基上經(jīng)4次交叉劃線分離.

(2)復(fù)篩：對(duì)初篩得到的單菌落進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察，根據(jù)生長(zhǎng)曲線的變化觀察生物量的增減情況，對(duì)木質(zhì)素氧化酶進(jìn)行顯色反應(yīng)確定酶存在情況，從而選出具有一定酶活力的白腐真菌.

1.3.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將鏡檢得到的符合白腐真菌特征的菌種，用打孔器以點(diǎn)狀的形式接種到PDA平板培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中30 ℃恒溫培養(yǎng)，每12 h測(cè)量菌種的直徑.按照真菌菌落的觀察法，初劃分為某幾種菌，并以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌落直徑為縱坐標(biāo)，繪制白腐真菌生長(zhǎng)曲線[6].

1.3.3 錳過(guò)氧化酶(MnP)的定性測(cè)定

將分離劃線篩選出的菌株接種于加入0.1 g/L MnCl2·4H2O的PDA培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，平板上形成黑棕色斑點(diǎn)[7]，指示有錳過(guò)氧化酶的合成.

1.3.4 木質(zhì)素過(guò)氧化酶(LiP)的定性測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用的是亞甲基藍(lán)(MB)法[8]，通過(guò)指示劑顏色的變化測(cè)定LiP的存在.LiP的定性反應(yīng)混合液2.7 mL：2.2 mL酶液，0.1 mL的1 mmol/L的MB,0.3 mL的0.5 mol/L的酒石酸鈉緩沖成分( pH 4.0)，加入0.1 mL的4.5 mmol/L的H2O2啟動(dòng)反應(yīng).將有酶液體系的顏色變化，與以蒸餾水取代酶液的體系的空白進(jìn)行比較，對(duì)LiP進(jìn)行定性測(cè)定.在 LiP 的催化下，亞甲基藍(lán)MB發(fā)生脫甲基反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為天青C，同時(shí)，MB由略顯綠的藍(lán)色，變?yōu)樽纤{(lán)色的天青C.

粗酶液的制備：取出2.0 g發(fā)酵有菌的培養(yǎng)基，加入25 mL的蒸餾水，振蕩浸提2 h.過(guò)濾去除殘?jiān)x心后(3 000 r/min，10 min)取上清液用于測(cè)酶活[9].

1.3.5 濾紙條崩解實(shí)驗(yàn)

稱取剪成1 cm 寬的濾紙條0.50 g 作為白腐真菌生長(zhǎng)的唯一碳源，將其放置于100 mL 除去葡萄糖的濾紙條培養(yǎng)基中，接種5 mL 篩選菌液放在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)6 d,進(jìn)行4 000 r.min-1離心，去除上清液后，用鹽酸和硝酸混合液(1∶1)沖洗而消除菌體，離心，清水洗滌，離心后105 ℃烘干并稱重，計(jì)算失重量和失重率[10]，并觀察濾紙降解情況，從中挑選出濾紙降解快、失重率高的菌種做進(jìn)一步研究.

濾紙失重率(%)=(A-B)/A×100%

(1)

其中：A—降解前濾紙質(zhì)量，g；B—降解后濾紙質(zhì)量，g.

1.3.6 固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

菌液培養(yǎng): 將篩選出的菌株在斜面固體PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行種子活化，培養(yǎng)7 d，將活化的斜面接種入液體土豆培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5～7 d，即得種子液(培養(yǎng)溫度為30 ℃).

稻草基質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng): 配制固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌，按10%的接種量接入上述培養(yǎng)好的種子液，30 ℃靜置培養(yǎng).每5 d取固體發(fā)酵樣品,用150 mL pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液浸泡3 h,過(guò)濾,濾液待用,濾渣于60 ℃烘干,用于測(cè)定其木質(zhì)素的含量.

木質(zhì)素含量的測(cè)定方法：采用文獻(xiàn)[11]中的差重法計(jì)算,并計(jì)算其降解率.

木質(zhì)素降解率(%)=(1-A/B)×100 %

(2)

其中：A—降解后木質(zhì)素含量，g；B—降解前木質(zhì)素含量，g.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的初篩

實(shí)驗(yàn)對(duì)朽木樣品進(jìn)行乙醇消毒預(yù)處理，可以初步殺死一些雜菌，采用葡萄糖為碳源，主要用于擔(dān)子菌以外的其他菌種，尤其是對(duì)細(xì)菌和霉菌具有抑制作用，但其營(yíng)養(yǎng)成分卻能滿足白腐真菌生長(zhǎng)發(fā)育的選擇平板培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng).對(duì)5種菌源A～E對(duì)照培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將朽木小塊均勻?yàn)⒌脚囵B(yǎng)基表層更有利于白腐真菌的生長(zhǎng)，這正符合其好氧的特性.

表1 菌落特征表

在10個(gè)培養(yǎng)基上，根據(jù)白腐真菌的菌落特征(菌體呈絨毛狀或粉狀，菌落扁平、生長(zhǎng)均勻，有同心圓或放射線)選出長(zhǎng)勢(shì)較好，疑似白腐菌的11株菌落以及1株未知菌落，依次編號(hào)(未知菌落的編號(hào)為L(zhǎng)12)，如表1所述.挑取每株菌落于PDA平板培養(yǎng)基上和選擇平板培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)4次交叉劃線分離，在培養(yǎng)基中的第三條線和第四條線上均有一個(gè)一個(gè)的單獨(dú)菌落生成.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比較選擇培養(yǎng)基里的菌落的生長(zhǎng)緩慢、稀疏、顏色淡，PDA培養(yǎng)基里的菌種則生長(zhǎng)尤為茂盛、密實(shí)且潔白有光澤，不足處是因?yàn)槠溥m合很多菌的生長(zhǎng)，所以培養(yǎng)過(guò)程會(huì)被雜菌感染，出現(xiàn)綠色的菌落.不同的培養(yǎng)基有不同的功效，所以結(jié)合起來(lái)使用更方便菌種的純化，而且縮短了分離周期.

2.2 菌株的復(fù)篩

2.2.1 鏡檢

對(duì)初篩選出的12組菌種在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，進(jìn)一步確定菌株的個(gè)體形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編號(hào)為B2、C3、E5、I9、K11的培養(yǎng)基里的白色菌落經(jīng)染色后，在100倍的目鏡下觀察到大量的發(fā)達(dá)菌絲，絲內(nèi)含有大量的細(xì)胞核，且菌體存在一定量的分生孢子和孢子囊，如圖1所示.

圖1 菌落鏡檢形態(tài)圖

從圖1可以看出，除C3菌和K11菌有少量的鎖狀結(jié)構(gòu)，其余菌株幾乎無(wú)隔膜菌絲，無(wú)鎖狀聯(lián)合，這符合相關(guān)資料對(duì)白腐真菌的形態(tài)描述，而其他7種菌落的鏡檢結(jié)果多為點(diǎn)狀.所以選擇上述5種菌株進(jìn)行下一步鑒定.

2.2.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)每隔12 h測(cè)定一次菌落的生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

圖2 生長(zhǎng)曲線

從圖2中可以看出，C3菌生長(zhǎng)速度較緩慢，而E5菌的生長(zhǎng)速度最快，其他3種菌生長(zhǎng)速度基本一致，即開(kāi)始隨天數(shù)的增加,其生物量呈線性增加;在一定天數(shù)后,其生物量增加變緩,有些菌株生物量開(kāi)始減少,出現(xiàn)這種情況的原因是隨著天數(shù)的增加,液體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分消耗而使菌體進(jìn)入次生代謝，或是菌株出現(xiàn)了自溶現(xiàn)象等.整體而言，白腐真菌的生長(zhǎng)周期大致如下：調(diào)整期為0～1 d，營(yíng)養(yǎng)期為2～3 d，停滯期自第3天左右開(kāi)始，并延續(xù)1～2 d，隨后進(jìn)入繁殖期，生長(zhǎng)基本停止，甚至發(fā)生生物量的下降.

2.2.3 木質(zhì)素氧化酶的測(cè)定

白腐真菌在適宜的條件下，其菌絲首先用其分泌的超纖維氧化酶溶解秸稈表面的蠟質(zhì)，然后菌絲進(jìn)入秸稈內(nèi)部，應(yīng)答合成多種酶，并分泌到細(xì)胞外，構(gòu)成降解系統(tǒng)的主要成分.其中關(guān)鍵的兩類(lèi)過(guò)氧化物酶——錳過(guò)氧化酶和木質(zhì)素過(guò)氧化酶，在分子氧的參與下，依靠自身形成的H2O2，觸發(fā)啟動(dòng)一系列自由基鏈反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)秸稈中木質(zhì)素?zé)o特異性的徹底氧化.因此，在選菌過(guò)程中，對(duì)這兩類(lèi)酶進(jìn)行測(cè)定很重要，測(cè)定結(jié)果如下.

(1)錳過(guò)氧化酶(MnP)的測(cè)定：將5種菌接種于加入0.1 g/L MnCl2·4H2O于PDA培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)B2菌和E5菌的培養(yǎng)基上出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，說(shuō)明這兩種菌產(chǎn)生了 MnP ，如圖3所示，而其余的培養(yǎng)基上無(wú)此情況.

圖3 B2菌(左)和E5菌(右)的MnP測(cè)定結(jié)果

對(duì)比圖3兩圖中的斑點(diǎn)數(shù)，發(fā)現(xiàn)B2菌所產(chǎn)生黑棕色斑點(diǎn)明顯多于E5菌.分析原因有兩方面：一方面與初始接種量有關(guān)，另一方面可能是由于菌株源于不同朽木，由于各種自然原因而導(dǎo)致錳過(guò)氧化酶的產(chǎn)量差距.

(2)木質(zhì)素過(guò)氧化酶(LiP)的測(cè)定：應(yīng)用亞甲基藍(lán)法，取6個(gè)試管，依次編號(hào)，加入2.2 mL木質(zhì)素過(guò)氧化酶，試管6加入2.2 mL的蒸餾水作為對(duì)照，其余試劑加入量相同，當(dāng)加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng)后，發(fā)現(xiàn)試管1和試管3由略顯綠的藍(lán)色變成紫藍(lán)色，表明B2菌和E5菌存在LiP.

2.3 濾紙條崩解實(shí)驗(yàn)

此實(shí)驗(yàn)主要是分析菌株的纖維素降解能力，選用濾紙條失重率這一指標(biāo)對(duì)B2、C3、E5、I9、K11號(hào)菌株進(jìn)行進(jìn)一步的篩選.經(jīng)過(guò)為期6天的觀察培養(yǎng)，5個(gè)菌株對(duì)濾紙條的降解結(jié)果如表2所示.

表2 濾紙條降解結(jié)果

以失重率>25%為界限,篩選出B2菌及E5菌，其中B2菌的濾紙失重率最大，為31.04%，其次是E5菌，濾紙失重率為25.59%，說(shuō)明B2菌和E5菌能有效降解濾紙，具有較強(qiáng)的纖維素降解能力，這與菌株的木質(zhì)素氧化酶存在情況相符合.其余的菌株雖具有一定的降解能力，生物特性也符合白腐真菌的相關(guān)描述，但不具有木質(zhì)素氧化酶，所以降解效率較低，這表明這些菌株可能不是白腐真菌.故選擇B2和E5白腐菌菌株，來(lái)研究其木質(zhì)素降解能力.

2.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

通過(guò)差重法測(cè)定，兩株白腐真菌對(duì)玉米秸稈中木質(zhì)素20天內(nèi)的降解率如圖4所示.

圖4 兩種菌株固體發(fā)酵的木質(zhì)素降解效率

從圖4圖形走勢(shì)可以看出，B2號(hào)菌和E5號(hào)菌在0～10天的時(shí)間內(nèi)降解速率較快，以后成緩慢減速狀態(tài)，這與白腐真菌的生長(zhǎng)曲線相符合，在降解20天后，B2和E5菌的降解效率分別約為33.7%、30.7%，B2菌的降解速率要高于E5菌，這與MnP的測(cè)定結(jié)果以及濾紙條失重率的結(jié)果相符合.

結(jié)果表明,菌株B2和E5對(duì)木質(zhì)素的降解效率和酶存在情況有很大的聯(lián)系，而這兩株菌體能在20 d內(nèi)對(duì)木質(zhì)素高聚物保持穩(wěn)定降解，說(shuō)明菌株B2和E5具有較強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力，可擴(kuò)大培養(yǎng)，為后續(xù)的秸稈綜合利用試驗(yàn)提供優(yōu)良的微生物源.

3 結(jié)論

(1)通過(guò)分離篩選及鑒定，從來(lái)自秦嶺山的多年朽木中獲得5株形態(tài)特征符合白腐真菌的生物特性的菌株，但只有B2菌與E5菌存在木質(zhì)素氧化酶(LiP和MnP)，表明這兩種菌株具有一定的木質(zhì)纖維素降解酶活，屬于白腐真菌.

(2)利用濾紙條崩解實(shí)驗(yàn)分析菌株的纖維素降解能力，B2菌的濾紙失重率最大為31.04%，E5菌的失重率次之，為25.59%，表明B2菌和E5菌能夠有效降解濾紙，具有較強(qiáng)的纖維素降解能力.

(3)通過(guò)差重法測(cè)定固體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中木質(zhì)素降解效率，在25 ℃發(fā)酵20 d時(shí)， B2菌和E5菌的降解效率分別約為33.7%、30.7%，說(shuō)明兩菌株具有較強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力，且B2菌的降解效果優(yōu)于E5菌.因此，這兩菌株可作為秸稈木質(zhì)纖維素降解菌進(jìn)行研究，但是對(duì)于木質(zhì)素酶和降解效率的關(guān)系仍需進(jìn)一步探究.

[1] 黃 茜,黃鳳洪,江木蘭,等.木質(zhì)素降解菌的篩選及混合菌發(fā)酵降解秸稈的研究[J].中國(guó)生物工程,2008,28(2):66-70.

[2] 郁紅艷,曾光明,黃國(guó)和，等. 木質(zhì)素降解真菌的篩選及產(chǎn)酶特性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2004,10(5):639-642.

[3] 章燕芳,李華鐘,華兆哲,等.木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶對(duì)染料脫色性能比較[J].環(huán)境科學(xué)研究,2002,15(5):17-22.

[4] 李慧蓉.白腐真菌生物學(xué)和生物技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:12-49.

[5] 李海紅,常華,袁月祥，等.復(fù)合菌劑預(yù)處理對(duì)秸稈厭氧發(fā)酵的影響[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,42(6):949-952.

[6] 張紅丹,杜 茜,張正坤,等.放線菌769抑菌譜及液體培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定[J].中國(guó)植保導(dǎo)刊,2010,30(3):4-8.

[7] Yu G C,Wen X H,Qian Y.Production of the ligninolytic enzymes by immobilized phanerochaete chrysosporium in an air atmosphere[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2005,21(3):323-327.

[8] Jeffries T W,Choi S,Kirk T K.Nutritional regulation of lignin degradation by phanerochaete chrysosporium[J].Appl.Environ.Microbiol.,1981,42(2):290-296.

[9] 陳 合,張 強(qiáng).菌酶共降解玉米秸稈的工藝研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(3):270-271.

[10] Keyser P,Kirk T K,Zeikus J G.Ligninolytic enzyme system of phanerochaete chrysosporium synthesized in absence of lignin in response to nitrogen starvation[J].Journal of Bacteriology,1978,135:790-797.

[11] 薛惠琴,杭怡瓊,陳 誼,等.稻草秸稈中木質(zhì)素、纖維素測(cè)定方法的研討[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2001,(2):15.