馬宏瑞， 羅 茜， 朱 超

(陜西科技大學 資源與環(huán)境學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

脂肪酶(EC3.1.3.3)是一種重要的工業(yè)酶類.在油脂化工和有機合成中，脂肪酶具有條件溫和、耗能低、原料要求低、成品質量高等優(yōu)點，尤其是1，3位專一脂肪酶，可用于特殊脂肪酸、單甘酯的合成及立體選擇性化學合成和拆分，具有巨大的應用潛力[1,2].在脂肪酶的廣泛來源中產自微生物的脂肪酶最具研究價值.近二十年來，被深入研究和應用于工業(yè)生產的微生物脂肪酶種類不斷增加，并借助于遺傳工程提高了脂肪酶的產量.目前其在食品生產加工、乳制品、藥物、洗滌劑、紡織、生物柴油和化妝品行業(yè)領域中都有應用[3,4].洗滌劑行業(yè)是脂肪酶的主要應用領域[5]，脂肪酶的添加增加了洗滌劑去除頑固油漬的能力，同時具有環(huán)境友好性[6].

但脂肪酶也存在穩(wěn)定性差、底物的不溶于水、酶的來源面較窄、提純困難以及極端環(huán)境應用受限，特別是工業(yè)用酶在某些生產工藝中面臨易受產物和抑制劑的抑制，且半衰期短以及工藝要求的溫度和pH不在酶反應的最適條件范圍內等問題[7,8].到目前為止各國仍在努力尋找和研究不同來源的具有潛在應用價值的微生物脂肪酶，以滿足各方面的不同要求[9].從某些極端或特殊生產環(huán)境中分離具備一定抗性的產脂肪酶微生物是擴大脂肪酶來源的重要方法之一.制革污泥生產環(huán)境中的主要成分為: 蛋白質、油脂混合物、鉻、鈉等的氯化物、硫化物、硫酸鹽以及少量的重金屬鹽等，還含有Al、Mn、Pb、Ti、Fe等微量元素，鉻、鈣、鈉、硫化物、硫酸鹽及氯化物的含量較高[10]，同時，還具有各類有抗性的微生物.目前還未見從含鉻制革污泥這種特殊環(huán)境中分離產脂肪酶菌株的相關報道.

本研究的目的在于從制革廠污泥中分離潛在的具有高產酶能力的菌株并進行初步的產酶條件優(yōu)化，為今后的進一步應用起到指導作用.

1 材料和儀器

1.1 材料

1.1.1 分離樣品

本實驗所用產脂肪酶微生物分離樣品來自于海寧某牛皮制革廠的綜合污泥，污泥烘干至105 ℃時含水率為14.4%，樣品性質見表1.

表1 污泥所含主要元素檢測結果

1.1.2 培養(yǎng)基

溴甲酚紫平板篩選培養(yǎng)基(g/l)：橄欖油乳化液100，(NH4)2SO41，K2HPO41，KCl 0.5，NaCl 1，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO40.1，1.6%溴甲酚紫 1，瓊脂15，用NaOH調節(jié)到pH 6.5～7.0；羅丹明B培養(yǎng)基(g/l)：橄欖油乳化液100，(NH4)2SO41，K2HPO41，KCl 0.5，NaCl 1，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO40.1，0.2%羅丹明溶液 1，瓊脂15，用NaOH調節(jié)到pH 6.5～7.0；富集培養(yǎng)基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母提取物 5，NaCl 10，瓊脂 15，用NaOH調節(jié)到pH 7.0；種子液培養(yǎng)基(g/l)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，用NaOH調節(jié)到pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：蔗糖 60，豆餅粉20，KH2PO43，MgSO4·7H2O 2，KCl 0.5，(NH4)2SO45，橄欖油30 mL/L，用NaOH調節(jié)到pH 7.0～7.2.

1.2 主要儀器

420-BS電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博泰)；HC-3018R高速冷凍離心機(安徽中科中佳)；PHC-3C雷磁pH儀(上海精科)；RH-QG型全溫光照振蕩器(金壇市金南儀器)；HS-1300-V型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；T-gradient型PCR儀(美國ABI)；Gel-Doc2000凝膠成像儀(英國SYNGENE).

2 實驗方法

2.1 菌株初篩

取5 g分離樣品加入40 mL無菌水，震蕩，靜置，取上清液梯度稀釋至10-5，取10-4稀釋水樣0.5 mL分別涂布于6個羅丹明 B培養(yǎng)基和溴甲酚紫培養(yǎng)基，各設三個平行；取10-5稀釋水樣0.5 mL分別涂布于6個羅丹明B培養(yǎng)基和溴甲酚紫培養(yǎng)基，各設三個平行，共制作12個平板.培養(yǎng)皿分別放入15 ℃、30 ℃和40 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將未進行淹水培養(yǎng)的平板按照同樣的方式進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3 d.

2.2 平板復篩

從初篩平板生長菌落中挑選出16株變色圈較大且具有代表性的微生物，進行平板劃線，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d.

2.3 平板復壯

挑取劃線培養(yǎng)的單菌落接種于30 mL的種子培養(yǎng)基中，于28 ℃，150 r/min條件下震蕩培養(yǎng)24 h.

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液按5%(V/V)的接種量接種于30 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)72 h.

2.5 酶活測定

取30 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，在4 000 r/min下離心10 min后，取上清液進行酶活的測定.測定方法為改進后的堿滴定法：取50 mL燒杯2只，分別加入PVA橄欖油5 mL和0.05 mol/L、pH=10.30 甘氨酸-NaOH緩沖液4 mL，在25 ℃水浴中預熱10 min后，加酶液1 mL，并立即計時，反應10 min后立即加入15 mL工業(yè)乙醇終止反應.用0.05 mol/L NaOH標準溶液進行滴定，pH值10.50為終點，對照樣品的乙醇應在酶液之前加入.在反應條件下，每分鐘水解產生1μg分子脂肪酸的酶量定義為一個脂肪酶國際單位.酶活計算公式如下：

(1)

式中V為測定樣品耗堿毫升數(shù)；V0為對照樣品耗堿毫升數(shù)；t為反應間(min)；50為1 mL 0.05 mol/L NaOH的微克分子數(shù)；n為釋倍數(shù).

2.6 二次發(fā)酵培養(yǎng)和酶活測定

選酶活較高的株菌直接使用其發(fā)酵液作為接種物進行二次發(fā)酵培養(yǎng)，方法同2.4，接種量為2.5(V/V)，并測定酶活，酶活最高者作為候選菌株，并進行后續(xù)試驗.

2.7 菌株形態(tài)學鑒定及生理生化特征

觀察菌株TeratosphaeriaceaeCr12在平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結果.生理生化測定參照文獻進行[8,11].

2.8 菌株分子生物學鑒定

參考Kim等[12]和Rainey等[13]的方法少量提取總DNA.引物為真菌通用18Sr RNA ITS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和Fungi (5′-CATTCCCCGTTACCCGTTG-3′).PCR擴增體系：DNA(70 ng/μL)模板2μL;dNTPMixture (2.5 mM) 2.5μL; 27 F (20μM) 1.5μL; 1492R(20μM)1.5μL;10×Ex Taq Buffer(Mg2+ plus )5μL;Ex Taq酶(5 U/μL)0.2μL；補足ddH2O到50μL.PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸3 min, 30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min.Ex Taq DNA Polymerase等擴增所用試劑均購自TaKaRa公司，PCR Purification Kit購自Promega,引物由上海生工合成.PCR產物經試劑盒純化(Axygen)，連接到pMD18-T載體上，并轉化至DH5α感受態(tài)細胞中后外送測序.序列提交NCBI數(shù)據庫，使用Clustal X軟件比對后，用Mega 5.1構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹.

2.9 產酶條件優(yōu)化

分為以下條件的優(yōu)化，所有處理設置三個平行，之后進行酶活的測定.

2.9.1 接種量的優(yōu)化

總發(fā)酵體積為100 mL，按體積比分別接種1.5%、2.5%、3.5%、4.5%和5.5%，接種液為種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)物.培養(yǎng)時間為72 h，培養(yǎng)溫度28 ℃，初始pH為6，轉速150 r/min.

2.9.2 發(fā)酵周期的優(yōu)化

在2.9.1的基礎上設置不同的發(fā)酵時間，分別為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h.

2.9.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

在2.9.1的基礎上設置不同的發(fā)酵溫度，分別為10 ℃、15 ℃、20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃.

2.9.4 初始pH的優(yōu)化

在2.9.1的基礎上設置不同的發(fā)酵初始pH值，分別為5、5.5、6、6.5、7、7.5、8和9.

2.9.5 種齡的優(yōu)化

在2.9.1的基礎上選取不同種齡接種物進行接種，分別為6 h、12 h、18 h、24 h、30 h.

2.9.6 保存時間對酶活的影響

將最優(yōu)條件下所產酶提取在4 ℃下保存不同的時間，分別為0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，之后分別測酶活.

3 結果與討論

3.1 脂肪酶產生菌篩選結果

對平板篩選出的16株菌進行劃線培養(yǎng)，得到單菌落，使用單菌落在種子培養(yǎng)基中進行接種液培養(yǎng)，后進行發(fā)酵培養(yǎng)，并測定其酶活，通過酶活測定以及平板篩選時菌株在羅丹明B培養(yǎng)基上長出的透明圈的大小兩個指標共同判斷菌株的產脂肪酶能力的大小，結果見表2.經復篩后，確定命名為TeratosphaeriaceaeCr12(表中T. Cr12)作為后續(xù)試驗菌株.

表2 平板篩選酶活測定結果

3.2 菌種形態(tài)學特征

菌株TeratosphaeriaceaeCr12的平板培養(yǎng)形態(tài)如圖1.

圖1 脂肪酶產生菌Cr12的菌落形態(tài)

該菌為革蘭氏陽性菌.菌株30℃ 72 h在瓊脂糖培養(yǎng)基上形成直徑約為50 mm，圓形、扁平、邊緣較整齊、表面光滑濕潤、半透明、呈淡橘紅色，長時間放置后表面變成微細粉末狀或顆粒狀.

3.3 部分生理生化性質測定結果

表3為篩選菌株Cr12的部分生理生化特性，由表可知該菌株為專性需氧菌，不具備蛋白水解酶，耐高溫生長.從鳥氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解.

表3 產脂肪酶菌株Cr12部分生理生化特性

酶試驗結果為陰性可知Cr12蛋白質利用能力有限.Cr12可在沙堡弱培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂上生長，菌落淡橘紅色或橘黃色，可確定為真菌.后續(xù)分子生物學鑒定因此基于18S rRNA進行.

3.4 菌株Cr12的分子生物學鑒定

18S rRNA序列是真核生物分子鑒定的重要指標，是真菌分子系統(tǒng)進化研究的標準.通過測定菌株Cr12的16S rRNA部分序列(登錄號為KF646801)并在GeneBank中進行序列的Blast比對，選出部分參比序列進行系統(tǒng)進化樹的構建，經鑒定命名分離株為TeratosphaeriaceaeCr12.

由圖2可見Cr12在系統(tǒng)進化樹上與Teratosphaeriaceaesp.的親緣關系最近，推測其為同源種.作為outgroup的貝氏硫細菌(Begglatoaalba)某株在進化樹上獨成一枝，和其他真菌參比序列明顯分離，證實了真菌簇的聚類是合理的.

圖2 基于18S rRNA的部分以NJ法構建的系統(tǒng)進化樹

3.5 發(fā)酵條件對菌株Cr12的脂肪酶活力影響

圖3為接種量對菌株Cr12的脂肪酶活力的影響.

圖3 接種量對堿性脂肪酶酶活的影響

由圖3可知，當接種量為2.5%時，脂肪酶活力達18.62 U/mL最高.當接種量超過2.5%，酶活開始下降，可能是高接種量帶來的種群規(guī)模增長過快導致的密度制約.

圖4為發(fā)酵周期對菌株Cr12的脂肪酶活力的影響.

圖4 發(fā)酵周期對堿性脂肪酶酶活的影響

發(fā)酵周期為72 h時，脂肪酶活力最大，達19.25 U/mL，周期過長會導致酶活的下降，可能是菌株發(fā)酵后期其他代謝產物的抑制作用.

圖5為發(fā)酵溫度對菌株Cr12的脂肪酶活力的影響.

圖5 發(fā)酵溫度對堿性脂肪酶酶活的影響

由圖5可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，脂肪酶的活力增大.到 30 ℃時，脂肪酶活力最大，超過30 ℃，酶活下降.因此，適宜的產酶溫度為 30 ℃，這基本符合真菌的最適生長溫度，但菌株Cr12在35 ℃甚至是40 ℃也有產酶活力，說明該分離株對制革污水的高溫表現(xiàn)出適應性.

圖6為起始 pH值對菌株Cr12的脂肪酶活力的影響.

圖6 初始pH值對堿性脂肪酶酶活的影響

結果表明，培養(yǎng)基起始pH值為6.5左右時，脂肪酶活力最大，為19.78 U/mL.說明脂肪酶產生菌Cr12在中性偏酸條件下有利于脂肪酶的合成和分泌，這也基本符合真菌生存的環(huán)境pH值.

圖7為種齡對菌株Cr12 的脂肪酶活力的影響.

圖7 種齡對堿性脂肪酶酶活的影響

結果顯示，接種種齡在18 h，脂肪酶活力達 18.85 U/mL.一般接種種齡以對數(shù)生長期的后期較為適宜，太年輕的種子接種后往往會出現(xiàn)發(fā)酵前期菌體生長緩慢，延長發(fā)酵周期 ；過老的種子雖然菌量較多，但接種后菌體會過早自溶，導致生產能力下降.而且一般真菌生長速度較細菌緩慢，所以在種齡適當老于細菌發(fā)酵種子效果會好些.

圖8為不同保存時間下的酶活，提取酶液后即刻測定酶活最高.

圖8 保存時間對脂肪酶酶活的影響

結果顯示，當保存時間到從0～3 h時酶活急劇下降至初始酶活的將近50%，保存時間從3～6 h酶活逐漸下降至初始酶活的11%左右.說明菌株Cr12所產生脂肪酶半衰期大概為3 h.

綜上可知，本研究所分離菌株Cr12為子囊菌門煤炱目下Teratosphaeriaceae的一種，能夠在含鉻2.77%的制革污泥中存活，并在高溫環(huán)境下保持產酶活性，說明極端環(huán)境下存在產脂肪酶真菌，這與子囊菌門成員本身代謝速率快[14]、世代時間較短[15]、缺少有性繁殖[16,17]帶來的高進化速率和變異性高度相關.

4 結論

本研究利用平板篩選法從含鉻制革污泥中篩選出 6株產脂肪酶細菌，進一步測其搖瓶發(fā)酵脂肪酶活力，選出一株脂肪酶活力最高的菌株Cr12，通過細菌形態(tài)、生理生化特性和分子生物學方法確定其為子囊菌門煤炱目下Teratosphaeriaceae的種屬.另外對Cr12產脂肪酶進行了搖瓶發(fā)酵優(yōu)化，得到Cr12最佳發(fā)酵條件為初始pH為6.5，培養(yǎng)溫度為30 ℃，接種量(V/V)為 2.5% ，發(fā)酵周期72 h，脂肪酶活力達到18.62～19.78 U/mL，雖然酶活較之已有研究有些低，但屬于特殊工業(yè)環(huán)境下的產脂肪酶微生物資源的開發(fā)，豐富了產脂肪酶微生物家族成員，對于產耐鉻脂肪酶編碼基因的研究提供了基礎.

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