龔國(guó)利， 劉麗麗， 王 娜， 游銀偉

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高新技術(shù)研究中心， 山東 濟(jì)南 250100)

0 引言

微生物固定化技術(shù)是利用化學(xué)或物理方法將細(xì)胞或微生物固定于材料的限定空間內(nèi)[1].目前的固定方法主要有包埋法、吸附法、交聯(lián)法，包埋法雖操作簡(jiǎn)單但不適用于微生物固定，其應(yīng)用仍停留在試驗(yàn)階段[2].多孔陶瓷吸附固定微生物技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)，尤其以無(wú)機(jī)材料為最.多孔陶瓷固定微生物主要借助于靜電作用，對(duì)多孔陶瓷進(jìn)行酸堿或金屬鹽處理，可使其裸露出或吸附正離子，對(duì)微生物的吸附力加強(qiáng)[3].埃博霉素因其具有抗真菌和細(xì)胞毒活性，已成為研究的熱點(diǎn)[4,5].粘細(xì)菌作為埃博霉素的產(chǎn)生菌，如何提高其液體發(fā)酵產(chǎn)量是埃博霉素大規(guī)模生產(chǎn)的一大難題，若是以多孔陶瓷為載體對(duì)粘細(xì)菌進(jìn)行吸附，可能會(huì)解決粘細(xì)菌液體發(fā)酵中聚團(tuán)生長(zhǎng)的難題[6]，提高埃博霉素產(chǎn)量.

本研究以粘細(xì)菌為試驗(yàn)菌株，硅藻土基多孔陶瓷為載體，對(duì)多孔陶瓷的吸附性能進(jìn)行觀察與試驗(yàn)研究，并對(duì)多孔陶瓷吸附粘細(xì)菌的吸附條件進(jìn)行優(yōu)化，為固定化粘細(xì)菌發(fā)酵制備埃博霉素提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌種

粘細(xì)菌SoF5-09，實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏.

1.2 多孔陶瓷制備

將硅藻土、煅燒硅藻土、粘土、石蠟按質(zhì)量比40∶35∶15∶2稱量混合均勻，按粉料∶水=1∶10加入裝有球磨介質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室球磨機(jī)(上海新諾QM1SP4行星式球磨機(jī))300 r/min球磨30 min，80 ℃烘干打散后，加2% 40目木屑后混勻，噴灑5%蒸餾水制粒、陳腐后，壓片(5 MPa)成型，尺寸為Ф10×2 mm，300 ℃干燥4 h，并于1 000 ℃下煅燒30 min，獲得硅藻土基多孔陶瓷[7,8].制得多孔陶瓷的性能見表1.

表1 硅藻土基多孔陶瓷性能

1.3 多孔陶瓷處理

1.3.1 HCl處理多孔陶瓷

用0.2 mol/L HCl浸泡多孔陶瓷24 h后，傾去酸液用蒸餾水清洗，直至pH值接近中性.

1.3.2 FeCl3處理多孔陶瓷

以固液比1∶4的比例在多孔陶瓷中加入濃度為2 mol/L的FeCl3(pH=0.67)溶液，攪拌均勻后110 ℃烘干，每隔1 h攪拌一次，然后在馬弗爐中500 ℃煅燒3 h，室溫冷卻后用蒸餾水沖洗至無(wú)色后110 ℃烘干待用[9].

1.4 菌懸液制備

配制30 mL M26培養(yǎng)基于200 mL錐形瓶中，30 ℃ 200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3天；8 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，用30 mL蒸餾水重懸并打散菌體[10].同時(shí)采用干重法測(cè)定菌體濃度約為3.75 mg/mL.

1.5 吸附實(shí)驗(yàn)

用硅藻土基多孔陶瓷對(duì)粘細(xì)菌進(jìn)行吸附，按陶瓷和菌懸液比5 g∶100 mL，于30 ℃，100 r/min搖床條件下進(jìn)行吸附試驗(yàn)，每隔30 min取樣，測(cè)定多孔陶瓷吸附量.每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值以減少誤差.

1.6 分析方法

1.6.1 吸附量測(cè)定

將已吸附菌的多孔陶瓷于60 ℃烘干至恒重m0，再經(jīng)600 ℃灼燒30 min后稱重m1，兩者之差(m0-m1)為多孔陶瓷吸附量.

1.6.2 紅外與電鏡分析

用德國(guó)Bruker V70傅里葉變換紅外光譜分析儀測(cè)定多孔陶瓷的FTIR圖譜.

將已吸附菌的多孔陶瓷用2.5 %戊二醛浸泡固定12 h，蒸餾水清洗3次，經(jīng)30 %、50 %、70 %、85 %、95 %、100 %乙醇梯度脫水與乙酸異戊酯置換兩次后，進(jìn)行冷凍干燥[11].用日立S-4800型掃描電子顯微鏡觀察硅藻土基多孔陶瓷的微觀形貌.

2 結(jié)果與討論

2.1 多孔陶瓷吸附性能

2.1.1 不同處理方法對(duì)多孔陶瓷吸附量的影響

圖1為多孔陶瓷、HCl處理的多孔陶瓷與FeCl3處理的多孔陶瓷隨時(shí)間變化對(duì)粘細(xì)菌吸附量的變化曲線.從中看出，3種多孔陶瓷的吸附量均在3.5～4 h時(shí)達(dá)到飽和狀態(tài)，且經(jīng)FeCl3處理的多孔陶瓷對(duì)粘細(xì)菌的吸附量最高，主要是因?yàn)镕eCl3處理多孔陶瓷的過(guò)程中，會(huì)轉(zhuǎn)化成Fe2O3顆粒并粘附在多孔陶瓷表面，可中和陶瓷表面原有的負(fù)電荷，使其表面呈中性或帶正電[9]，可有效地吸附帶負(fù)電性的細(xì)菌.因此，本實(shí)驗(yàn)條件下，使用經(jīng)FeCl3處理的多孔陶瓷進(jìn)行粘細(xì)菌吸附試驗(yàn)較好.

2.1.2 FeCl3處理濃度選擇

圖2為不同濃度FeCl3處理的多孔陶瓷隨時(shí)間變化對(duì)粘細(xì)菌吸附量的變化曲線.隨著濃度增加，吸附量也隨之增加，可能是因?yàn)檎掣降腇e2O3越來(lái)越多的緣故；當(dāng)FeCl3濃度為2.5 mol/L時(shí)，對(duì)粘細(xì)菌的吸附量與經(jīng)2.0 mol/L FeCl3處理的多孔陶瓷的吸附量相差不大，可能是已達(dá)到吸附飽和的緣故.本實(shí)驗(yàn)條件下，選擇2.0 mol/L FeCl3處理多孔陶瓷.

圖1 不同處理多孔陶瓷對(duì)粘細(xì)菌吸附量變化

圖2 不同濃度FeCl3處理多孔陶瓷對(duì)粘細(xì)菌吸附量變化

2.1.3 多孔陶瓷的FTIR譜分析

圖3為硅藻土基多孔陶瓷與經(jīng)FeCl3處理的多孔陶瓷的FTIR譜分析結(jié)果.圖中480 cm-1附近處為Fe2O3的吸收峰，1 130 cm-1附近處為Si-O-Si的吸收峰[12]，且經(jīng)FeCl3處理的多孔陶瓷在這兩處的吸收峰明顯加強(qiáng)，說(shuō)明Fe2O3含量、Si-O-Si鍵增多；在1 600 cm-1、3 500 cm-1附近處為O-H的振動(dòng)峰[13]，經(jīng)FeCl3處理的多孔陶瓷在這兩處的振動(dòng)明顯降低，可能是因?yàn)樵谔幚磉^(guò)程中破壞了多孔陶瓷表面的結(jié)合水.這說(shuō)明經(jīng)FeCl3處理的多孔陶瓷在吸附粘細(xì)菌時(shí)有著更強(qiáng)的吸附作用.

圖3 多孔陶瓷的FTIR圖譜

2.1.4 多孔陶瓷的微觀形貌

粘細(xì)菌細(xì)胞柔軟，一般呈桿狀，如圖4(a)所示，本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的粘細(xì)菌長(zhǎng)約3～5μm，寬約1μm，且粘細(xì)菌無(wú)鞭毛，可分泌粘液，采用滑動(dòng)行為形成薄而擴(kuò)展的菌落[14].這種粘液可能有利于多孔陶瓷對(duì)粘細(xì)菌的吸附固定.本實(shí)驗(yàn)室自制的硅藻土基多孔陶瓷孔徑約5～10μm，經(jīng)FeCl3處理的多孔陶瓷表面及孔徑內(nèi)覆蓋有一層納米級(jí)Fe3O2顆粒(圖4(c)).在經(jīng)過(guò)吸附試驗(yàn)后，可以看出陶瓷孔隙內(nèi)有大量的粘細(xì)菌存在(圖4(d))，說(shuō)明所制的多孔陶瓷可以作為粘細(xì)菌的吸附載體.

圖4 樣品的SEM圖

2.2 吸附條件的研究

2.2.1 溫度對(duì)吸附量的影響

圖4為FeCl3處理的多孔陶瓷在不同溫度，100 r/min搖床條件下經(jīng)吸附4 h后吸附量的變化.

由圖可知，隨著溫度上升吸附量隨之增加，在30 ℃時(shí)達(dá)到最高，即11.85 mg/g.這可能是因?yàn)檎臣?xì)菌在30 ℃左右最為活躍，且溫度的上升有利于粘細(xì)菌向多孔陶瓷表面及孔徑內(nèi)擴(kuò)散.在35 ℃時(shí)吸附量急速下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的溫度使吸附的菌體不穩(wěn)定，易脫落.因此在本實(shí)驗(yàn)條件下，吸附溫度應(yīng)在30 ℃.

2.2.2 轉(zhuǎn)速對(duì)吸附量的影響

圖5為FeCl3處理的多孔陶瓷在30 ℃不同轉(zhuǎn)速條件下經(jīng)吸附4 h后的吸附量變化.隨著轉(zhuǎn)速的增大，吸附量隨之增加，因?yàn)檗D(zhuǎn)速的增加可加快粘細(xì)菌與多孔陶瓷的接觸機(jī)會(huì)，但過(guò)高的轉(zhuǎn)速也會(huì)增加多孔陶瓷間的摩擦碰撞，易使已吸附菌體掉落.因此在在本實(shí)驗(yàn)條件下，轉(zhuǎn)速應(yīng)在100 r/min.

圖5 溫度對(duì)吸附量的影響

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)吸附量的影響

2.2.3 吸附條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法，進(jìn)一步探討溫度、轉(zhuǎn)速、吸附時(shí)間對(duì)多孔陶瓷吸附粘細(xì)菌的影響.以吸附量為指標(biāo)，選用L9(34)表安排實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)吸附工藝.吸附試驗(yàn)采用的因素與水平見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.

表2 L9(34)因素水平表

由表3、4可知，溫度、轉(zhuǎn)速這兩個(gè)因素對(duì)吸附量的影響較大，主次次序是轉(zhuǎn)速、溫度、吸附時(shí)間，最優(yōu)方案是A2B2C1，即在30 ℃、100 r/min條件下吸附3.5 h吸附量效果最好.經(jīng)驗(yàn)證后，吸附量達(dá)14.45 mg/g.

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

3 結(jié)論

將硅藻土基多孔陶瓷作為粘細(xì)菌的固定載體是可行的.研究表明，在經(jīng)2.0 mol/L FeCl3處理的硅藻土基多孔陶瓷對(duì)粘細(xì)菌的吸附效果較好，吸附4 h后吸附量達(dá)10.6 mg/g；在對(duì)吸附試驗(yàn)的溫度、轉(zhuǎn)速、吸附時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化后，當(dāng)溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為100 r/min、吸附時(shí)間為3.5 h時(shí)吸附量最大，達(dá)14.45 mg/g.為下一步多孔陶瓷固定粘細(xì)菌發(fā)酵制備埃博霉素提供實(shí)踐基礎(chǔ).

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